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背景：斯氏狸殖吸虫散在流行于我国四川、重庆等15个省市自治区，给人们身体健康和国家经济建设造成了极大的危害。半胱氨酸蛋白酶存在于人类、寄生生物等多种动物体内。作为寄生虫的主要消化酶之一，半胱氨酸蛋白酶在寄生虫与宿主的相互关系上具有重要的作用。由于该酶在寄生虫病的免疫诊断、疫苗及化疗药物的研制上具有广阔的应用前景，因而寄生虫半胱氨酸蛋白酶正受到越来越广泛和深入的研究。然而对于仅流行于我国的斯氏狸殖吸虫，其半胱氨酸蛋白酶尚无相关研究。 目的：1、克隆斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶cDNA，获得其序列。2、进行原核表达，获得表达产物，并检测其免疫反应性。3、对半胱氨酸蛋白酶在斯氏狸殖吸虫的虫体表达进行组织定位。 方法：1、从四川兴文县采集溪蟹，分离斯氏狸殖吸虫囊蚴，经动物感染后获得成虫。利用TripureTM RNA提取试剂盒提取总RNA，进行RT-PCR。PCR中所用引物为根据相关虫种半胱氨酸蛋白酶保守氨基酸序列设计的简并引物。扩增片段纯化后，克隆入pUCm-T载体并测序，然后利用DNASIS程序推导其氨基酸序列，并与其它相关虫种半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行同源性分析。2、将获得的cDNA片段克隆入PinPointTM Xa-1 T表达载体，经过筛选后，在大肠杆菌中进行IPTG诱导的原核表达。通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和Western blot方法鉴定表达产物，并检测所表达融合蛋白的免疫反应性。3、利用克隆获得的cDNA，进行体外转录，获得地高辛标记的cRNA探针。对斯氏狸殖吸虫成虫进行冰冻切片，通过原位杂交的方法，对胱氨酸蛋白酶在斯氏狸殖吸虫的虫体表达进行组织定位。 结果：1、RT-PCR扩增出了一约500bp的条带，克隆、测序后获得3个囊蝴cDNA片段、1个成虫cDNA片段，在GenBank中注册后，获得4个序列号。序列分析发现，所获序列与相关寄生虫的半肤氨酸蛋白酶序列具有很高的同源性，且包含了与半肤氨酸蛋白酶活性相关的重要位点。2、原核表达中，对表达产物的鉴定结果显示，除了E.coli本身合成的22.skDa条带外，目的克隆和空载体分别在33kDa和13kDa处有一生物素化条带;免疫反应性检测结果显示，目的克隆在33kDa处有一明显条带。3、原位杂交结果显示，在斯氏狸殖吸虫虫体横切面上，肠管上皮出现阳性着色。 结论:1、通过RT一PCR克隆获得了斯氏狸殖吸虫半肤氨酸蛋白酶cDNA片段（psMCPI、psMCpZ、psMCP3和PsACP）;序列同源性分析显示，其序列与相关虫种半胧氨酸蛋白酶有很高的同源性，且包含了与该酶活性有关的重要位点。2、PsMCPI原核表达获得一33kDa的融合蛋白，该融合蛋白具有免疫反应性。扣除载体自身序列编码部分，目的蛋白分子量应为ZOkDa。3、利用原位杂交技术对斯氏狸殖吸虫半肤氨酸蛋白酶在虫体中的表达进行组织定位，结果显示，肠管上皮是尸skrj’abini表达半肤氨酸蛋白酶的主要部位。