毛囊是一个复杂的皮肤附属器官,它由上皮(毛母质与多层同心圆状结构)和真皮(毛乳头和结缔组织鞘)两大部分组成,其中包含有20余种细胞,包括角质形成细胞、黑色素细胞、Langerhans细胞、Merkel细胞、真皮鞘细胞和毛乳头细胞,这些细胞在体内经过复杂的相互作用,共同参与了毛囊的发育、生长、分化与周期性的调节。毛囊依靠周期性循环来实现毛发的生长与更新,根据毛囊形态上的变化可将其分为三个阶段:生长期(anagen)毛囊持续延长;退化期(catagen)毛乳头开始上移,毛母质细胞消失,毛囊逐渐缩短;静止期(telogen)时毛乳头到达真皮与皮下组织交界处,仅靠极小的上皮细胞索与毛囊相连。在毛囊生长的不同周期,一些活性蛋白、细胞因子及激素均可对毛囊周期或生长产生促进或抑制作用。寻找能够影响毛发生长的成分对阐明毛囊生长周期调控机制、发展治疗脱发的有效手段具有重要意义。目前研究表明,毛囊的发生发育及周期维持受到多种信号途径的调节,如Wnt、Bmp、Shh等,其中经典Wnt/β-catenin途径日益引起人们的关注,该途径被认为是毛囊周期维持不可或缺的通路。目前在哺乳动物中已发现19个Wnt蛋白家族成员,而且小鼠皮肤毛囊发育过程中同时存在多种Wnt的表达,其中包括了经典Wnts,也包括非经典Wnts。但是,迄今为止对该家族两大类Wnts在毛囊周期调控中的作用是否存在差异尚不明确。Wnt5a (wingless-type MMTV integration site family, member 5A)作为Wnt家族非经典Wnts的代表,在细胞的增殖、分化、迁移、运动、极性调节中有重要作用,其参与的信号网络复杂交错,除经典Wnt途径外还可激活多条非经典Wnt信号途径,如Wnt/Ca2+途径、PCP途径、Wnt/Ror2途径等。最近研究发现非经典Wnt5a途径能通过促进β-catenin降解,从而抑制经典Wnt/β-catenin途径的激活。为了更加清楚地了解Wnt5a在毛囊周期调控中的作用,本研究首先利用原位杂交、免疫组织化学、半定量RT-PCR和Western blot技术,观察Wnt5a在小鼠毛囊周期中的时空表达规律;其次在体外毛囊器官培养水平,采用腺病毒介导方式,检测Wnt5a对毛囊生长的调控效应;然后采用拔毛同步化动物模型,经皮内注射腺病毒,进一步从在体水平验证Wnt5a对毛囊生长的影响,并运用基因芯片检测、定量RT-PCR、IHC等技术,分析该效应可能涉及的作用机制。本研究主要结果如下:一、Wnt5a在小鼠毛囊周期中的表达规律1.以地高辛标记的Wnt5a RNA为探针,采用背皮whole-mount原位杂交技术观察到:①生长期毛球部有较强的Wnt5a mRNA信号,分布在matrix、IRS和DP,尤其是强增殖能力的matrix内可观察到大量的阳性细胞。大量Wnt5a由生长期毛囊细胞分泌,强烈提示它可能参与了对毛囊生长过程的调控。②进入退化期后,发生凋亡的毛球部阳性信号逐渐减少。③静止期毛囊中仅在DP见到少量Wnt5a mRNA表达。Wnt5a mRNA表达表现出显著的周期性变化。2.采用背皮组织的免疫组织化学方法观察到:①Wnt5a蛋白在生长期毛囊中分布广泛,除matrix、IRS、DP外,precortex细胞、ORS中也有分布,且表达量随毛囊生长逐渐增多。Wnt5a蛋白分布范围较mRNA更弥散,说明分泌Wnt5a的细胞和能接受Wnt5a信号的细胞可能不完全一致,提示Wnt5a在毛囊中的作用途径可能同时存在自分泌和旁分泌两种方式。②到退化期,上皮索的表达逐渐减少。③进入静止期,少量Wnt5a蛋白的表达仅局限于bulge区、secondary hair germ和DP。3.通过背皮组织半定量RT-PCR和Western blot技术观察到,Wnt5a mRNA和蛋白的表达趋势与原位杂交和IHC一致,均表现为生长期最丰富,退化期减弱,静止期最低。二、体外器官水平检测Wnt5a对毛囊生长的作用1.采用触须组织的免疫组织化学方法,观察到Wnt5a蛋白表达情况与背皮相似,说明这两种毛囊类型中Wnt5a可能发挥相似调控作用。2.利用腺病毒介导的方式,进行触须毛囊的体外器官培养,观察到:Wnt5a处理组毛囊的毛干伸出长度变短,提示Wnt5a对毛囊生长有抑制作用。三、动物在体水平进一步验证Wnt5a对毛囊生长的抑制作用1.建立小鼠拔毛诱导同步化模型,经皮内注射腺病毒,观察到Wnt5a组注射部位出现明显抑毛区,HE染色显示该区毛囊为静止期形态,而周边毛囊已经进入生长中期,提示Wnt5a抑制了由于拔毛所诱导的毛囊生长,干扰了毛囊anagen的进程。一段时间后,抑毛区会逐渐缩小直至消失,长出正常毛发,说明单一的Wnt因素只能短暂抑制毛囊生长。2.采用小鼠全基因组芯片检测及定量RT-PCR,发现注射Wnt5a后β-catenin的水平显著下调,提示Wnt5a的抑毛效应可能是通过抑制经典Wnt/β-catenin信号途径而达到的。同时检测到Rac2的表达显著上调,提示Wnt5a可能激活了沿Rac2的PCP途径信号链。3.经皮内注射干扰β-catenin的腺病毒Ad-SimBC后,小鼠毛囊表型及HE染色改变类似于Wnt5a处理组,提示它们可能涉及到相似的分子机制,即抑制了经典Wnt/β-catenin信号途径。4.对采用免疫组织化学染色技术检测Wnt5a处理组和SimBC处理组,观察到:经典Wnt/β-catenin信号途径的几个分子β-catenin、Lef1、Dvl,增殖指标Ki67和分化指标AE15表达均下降,进一步说明Wnt5a的抑毛效应可能是通过抑制经典Wnt/β-catenin途径导致的。总的来说,本课题通过一系列实验首先观察了Wnt5a在毛囊周期中的表达规律,然后分别在体外器官培养水平和动物在体水平,着重研究Wnt5a对毛囊生长的调控作用及可能的机制,旨在为深入研究不同Wnt信号在毛囊周期调控中的作用机理提供实验依据;为毛发的生长调节、皮肤组织工程提供一定的理论基础。