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本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 趋化因子CCR5促进内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位迁移的研究 目的： 探讨趋化因子CCR5在内皮祖细胞向内皮损伤部位迁移的趋化作用。 方法： 1.动物模型 10-12周龄的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于实验。选取8-10周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠用于内皮祖细胞提取。 2.脾切除手术 8-10周龄的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠给予0.8％戊巴比妥钠(10 mg/kg)麻醉，沿小鼠左侧腹部行10-15mm切口，脾脏周围的动静脉被结扎后移除脾脏，小鼠术后适应性喂养7-14天，再行后续实验。 3.小鼠2型糖尿病模型的建立 将脾切除的ApoE-/-C57BL/6J小鼠，按小鼠每公斤体重给予35mg链脲佐菌素(STZ，35mg/kg)，腹腔注射STZ溶液，间隔24h后再次腹腔注射给药，连续注射3天。对照组，ApoE-/-C57BL/6J小鼠腹腔给予等量的柠檬酸钠缓冲液。造模后每天检测小鼠体重变化，每周测量小鼠血糖，当血糖值在300 mg/dl及其以上者，作为2型糖尿病模型成功标准。 4.小鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 选取8-10周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下，分离提取小鼠胫骨，股骨和髂骨中的单个核细胞，梯度离心后接种在纤维连结蛋白包被的六孔板中，放置于37℃，5％ CO2孵箱中培养，三天后细胞第一次给予完全换液，弃掉未贴壁的细胞。第六天时，细胞给予半量换液，继续培养至第七天即用于鉴定。细胞分别给予DiI-acLDL，BS-1 lectin和DAPI染色后，荧光显微镜观察阳性染色细胞，三色荧光阳性染色的细胞即为内皮祖细胞。 5.慢病毒转染内皮祖细胞 将过表达CCR5质粒的慢病毒载体按MOI=40转染入内皮祖细胞中，携带有空白质粒的慢病毒载体转染入内皮祖细胞中作为阴性对照，转染24小时后给予完全换液，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，继续培养48-72小时。在内皮祖细胞移植之前，培养的细胞给予CM-DiI(4 mg/ml)活细胞染料孵育15分钟，双重标记的EPCs被收集，用于下一步试验。 6.试验设计 40只脾切除的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠给予高胆固醇饮食喂养24周，然后根据小鼠耳标号，应用随机数字表，将老鼠随机分为三组:Control组:尾静脉给予200μl无菌的PBS，Lenti-EGFP组:尾静脉给予200μl1×106携带有空载质粒的内皮祖细胞，Lenti-CCR5组:尾静脉给予200μl1×106携带有过表达CCR5质粒的内皮祖细胞。 7.免疫荧光检测 CD31免疫荧光染色检测小鼠主动脉根处内皮细胞表达分布。 8.内皮祖细胞功能学检测 Transwell迁移小室和Edu增殖能力实验分别检测内皮祖细胞的迁移和增殖能力。 9.统计学分析 所有统计学数据均使用SPSS18.0软件分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。当P＜0.05被认为具有显著性统计学差异。 结果： 1.成功构建重组过表达慢病毒载体 经重组慢病毒载体测序实验验证，CCR5慢病毒表达载体构建和包装成功，空白载体的慢病毒滴度为3×1010 ifu/ml，CCR5过表达载体的慢病毒滴度为2.8×1010 ifu/ml。 2.成功分离提取和鉴定EPCs EPCs培养至第7天，细胞分别给予DiI-acLDL（红色），BS-1 lectin（绿色）和DAPI（蓝色）染色后，结果发现90％以上细胞均能成功摄取DiI-acLDL和BS-1 lectin，表现为三色荧光（红色+绿色+蓝色）阳性。 3.慢病毒转染EPCs后感染效率 免疫荧光评价EPCs转染慢病毒后的感染效率，结果发现80％及以上的细胞为绿色荧光蛋白表达阳性细胞，提示慢病毒转染成功。 4.过表达CCR5增加EPCs向内皮损伤部位的归巢，动员 5.过表达CCR5增加EPCs迁移能力 为了检测CCR5对EPCs功能学影响，我们分别检测了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5两组细胞的增殖和迁移能力的变化。结果发现，在趋化因子CCL5存在的情况下，Lenti-CCR5组能明显增加EPCs迁移能力(P＜0.01)，但是两组细胞的增殖能力并未见明显差异（P=0.98）。 结论： 1.过表达CCR5能够增加内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位的归巢、动员作用; 2.过表达CCR5能提高内皮祖细胞迁移能力，但是对其增殖能力没有影响。 第二部分 过表达内皮祖细胞上CCR5改善动脉粥样硬化斑块稳定性 目的： 探讨过表达内皮祖细胞上CCR5对动脉粥样斑块稳定性研究。 方法: 1.动物模型 10-12周龄的ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于实验。选取8-10周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠用于内皮祖细胞的提取。 2.脾切除手术 8-10周龄的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠给予0.8％戊巴比妥钠(10 mg/kg)麻醉，沿小鼠左侧腹部行10-15mm切口，脾脏周围的动静脉被结扎后移除脾脏，小鼠术后适应性喂养7-14天，再行后续实验。 3.小鼠骨髓来源的EPCs分离、培养及鉴定 选取8-10周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下，分离提取小鼠胫骨，股骨和髂骨中的单个核细胞，梯度离心后接种在纤维连结蛋白包被的六孔板中，放置于37℃，5％CO2孵箱中培养，三天后细胞第一次给予完全换液，弃掉未贴壁的细胞。第六天时，细胞给予半量换液，继续培养至第七天即用于鉴定。 4.慢病毒转染内皮祖细胞 将过表达CCR5质粒的慢病毒载体按MOI=40转染入内皮祖细胞中，携带有空白质粒的慢病毒载体转染入内皮祖细胞中作为阴性对照，转染24小时后给予完全换液，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，继续培养48-72小时。 5.试验设计 60只脾切除的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠给予高胆固醇饮食喂养24周，然后应用随机数字表，将老鼠随机分为三组:Control组:尾静脉给予200μl无菌的PBS，Lenti-EGFP组:尾静脉给予200μl1×106携带有空载质粒的内皮祖细胞，Lenti-CCR5组:尾静脉给予200μl1×106携带有过表达CCR5质粒的内皮祖细胞。内皮祖细胞输注后，所有老鼠改为普通饮食，继续喂养6周后处死。 6.组织病理、免疫组化及免疫荧光检测 油红O染色实验评价小鼠主动脉根处动脉粥样斑块面积，免疫组织化学染色方法分别检测人和小鼠冠状动脉处CCL5和CCR5的表达、小鼠主动脉根处平滑肌α肌动蛋白、单核/巨噬细胞、内皮细胞，、炎症因子IL-6、MMP9等表达。免疫荧光染色方法检测小鼠主动脉根处内皮细胞表达。 7.免疫化学检测 小鼠给予内皮祖细胞移植后分别于0周和6周采集全血，高速离心后，收集血清。应用小鼠动脉粥样硬化相关的蛋白芯片检测动脉粥样硬化相关的22个炎症指标变化，Cluster version3.0和Java Tree View version1.60软件用于分析蛋白芯片的结果。 8.统计学分析 所有统计学数据均使用SPSS18.0软件分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。当P＜0.05被认为差异具有显著性统计学意义。 结果: 1.CCL5和CCR5在人和ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块中的表达和分布情况 2.过表达CCR5增加EPCs向内皮损伤部位的归巢，动员 3.过表达内皮祖细胞上CCR5对动脉粥样斑块稳定性影响 4.过表达内皮祖细胞上CCR5降低高脂血症水平 5.过表达内皮祖细胞上CCR5对内皮功能的影响 6.过表达内皮祖细胞上CCR5降低炎症因子表达 7.统计学分析 所有统计学数据均使用SPSS18.0软件分析。计量资料以均数土标准差表示，计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。当P＜0.05被认为差异具有显著性统计学意义。 结论: 1.趋化因子CCL5和CCR5在人和小鼠动脉粥样硬化斑块中表达增加; 2.过表达CCR5增加内皮祖细胞在动脉内皮损伤部位的聚集数量; 3.过表达CCR5增加动脉粥样斑块的稳定性，减少动脉粥样斑块面积; 4.过表达CCR5降低高脂血症小鼠血清中脂质水平; 5.过表达CCR5改善内皮细胞功能障碍; 6.过表达CCR5降低动脉粥样硬化小鼠全身和斑块局部的炎症反应.