乳酸菌及其代谢产物可有效抑制食品致病菌及腐败菌,常被作为新型生物保藏剂应用于各种食品中,符合当今消费者对健康和无化学添加饮食的追求。在多种乳酸菌代谢产物中,细菌素的应用前景最为乐观,从分子水平上对细菌素及其产生菌进行研究,将有助于对乳酸菌的进一步开发利用。本研究筛选的食用级乳酸菌所产生的细菌素和其他代谢产物存在协同作用,菌株作为保护菌株应用于混合沙拉和鲜切洋葱时,可显著抑制李斯特菌污染。为进一步研究其在鲜切制品贮藏逆境中的蛋白质表达情况,利用食品模拟培养基进行李斯特菌挑战性实验,考察了营养基质、接种水平、乳酸菌菌属和保藏温度对抑菌作用的影响。在鱼肉(三文鱼)模拟基质中,尽管乳酸菌能正常生长,但并不具备抑制李斯特菌的能力。在果(网纹甜瓜)蔬(生菜)模拟基质中,最高接种水平的乳酸菌抑菌效果最为明显。在10℃冷藏21天后,与对照组比较,接种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),屎肠球菌(Enterococcus faecium)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的水果和蔬菜样品分别能够抑制李斯特菌菌数4.5、4.4、3.8 log CFU mL-1和4.7、4.7、3.1 log CFU mL-1。整个冷藏过程中,乳酸菌在蔬菜基质中的抑菌效果更为明显。25℃作用72 h后,接种高水平乳酸菌的蔬菜样品中李斯特菌菌数比初始水平平均减少了1.1 log CFU mL-1,而水果基质中仅减少了0.2 log CFU mL-1。随着温度的降低,乳酸菌抑菌活性有所减弱,以嗜热链球菌最为明显,乳酸乳球菌抑菌活性则最为稳定。本研究为鲜切产品的保鲜应用提供了基础数据。为明确果蔬基质中乳酸乳球菌蛋白质组的特征与变化,本研究对蛋白质样品制备方法进行了优化,并建立了以液相等电聚焦分离(OFFGEL electrophoresis, OGE)技术为基础的蛋白质组学平台首先以蛋白质提取率及SDS-PAGE电泳图谱为评价标准,选择微玻璃珠研磨法-丙酮直接沉淀法作为乳酸乳球菌可溶性蛋白样品的最佳制备方法。然后利用OGE及四级杆-离子阱串联质谱(Q-TRAPMS)技术,构建了高通量的蛋白组学研究平台,并对乳酸乳球菌的蛋白质组进行了鉴定,OGE分离结果表明：在24组回收馏分中大部分肽段分布于第1-5个和8-11组馏分(实测pI范围3.4-6.2),两类馏分中蛋白鉴定数目分别占总量的39.4%和29.3%,；已鉴定肽段中有72.5%的肽段仅分布在1个馏分中,14.0%的肽段分布在2个馏分中。此外,7种重要氨基酸在肽段及馏分中的分布情况表明：在酸性范围的肽段(1-5组馏分)中平均含有2个谷氨酸(E)和1.3个天冬氨酸(D),这两种酸性氨基酸含量由酸性到碱性范围呈递减趋势；赖氨酸(K)和精氨酸(R)比重略高于预期,主要由于胰蛋白酶对个别肽段的漏切造成；半胱氨酸(C)及酪氨酸(Y)分布较为平均,组氨酸(H)在第6-9组馏分和15-19组馏分中的含量较高。研究数据表明OGE对复杂肽段具有良好的预分级效果,适用于乳酸菌蛋白质组学研究,相关数据可为目标蛋白质的富集提供依据。在上述方法的基础上,结合稳定同位素双甲基化标记手段及高分辨四级杆-时间飞行串联质谱(QTOF MS)技术,建立乳酸乳球菌蛋白质组的定量分析,以生长于水果和蔬菜基质中0、3和7天的Lact. lactis可溶性总蛋白质为分析样品,结果共鉴定蛋白质914-1192个,其中98和113个蛋白质分别在蔬菜和水果基质中呈显著调节表达。蛋白质组表达谱及聚类分析表明,.62.63%和34.17%的蛋白分别在蔬菜和水果基质中保持显著上调表达。蛋白质功能解析结果表明：1.受冷藏温度影响,乳酸乳球菌中有46组蛋白质在两种基质间具有相同的变化趋势,其中以冷激蛋白的比例最高；46组蛋白质的显著调节表现为多项防御及修复机制的启动、能量代谢的上调、蛋白合成底物需求的增加、及细胞被膜的调整。2.培养基质是影响乳酸菌代谢的另一个重要因素,不同基质中Lact. lactis参与氧化还原及解毒代谢蛋白质的表现复杂；除谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)和半胱氨酸合成酶(CS)在两种基质中共同上调外,谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)及铁硫装配蛋白SufD仅在水果基质中存在显著上调表达；GCL和CS参与胞内抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)及其元件的催化合成,GPX和SOD负责过氧化物和超氧化物的清除,这些结果说明乳酸乳球菌在水果基质中面临更为严重的氧化胁迫。3.在碳水化合物利用和代谢方面,蔬菜基质作用下Lact.lactis中的转运蛋白PTSMan亚基、糖酵解及丙酮酸代谢关键酶、脂肪酸起始及延长催化酶都发生显著上调表达；而在水果基质中多个相关蛋白质出现下调或恒定表达；Lact. lactis中碳源流向的差异表达反映了乳酸菌对蔬菜基质中多种糖源的最大吸收利用,及对水果基质中糖源水平的应答调节。以上结果证明乳酸乳球菌对所处环境的温度条件和营养成分具有良好的适应性。此外,多个参与细菌素合成与分泌的必需蛋白,肠道菌素EntP免疫蛋白质、肠道菌素EntA免疫蛋白质、前体蛋白移位酶亚基SecA和SecY,在逆境冷藏期间始终保持稳定表达,证明乳酸乳球菌中至少具有一种Ⅱa类细菌素的生产体系,在胁迫下仍保持乳酸菌的抑菌活性。本研究从蛋白质水平为保鲜乳酸菌应用菌株的选择提供了理论依据。研究获得的乳酸菌肽段OGE预分级特性及建立的乳酸乳球菌全蛋白信息库,为后续目标蛋白质,特别是产细菌素蛋白质的富集回收及绝对定量提供了科学依据。