辣椒再生体系的建立及其遗传转化的研究（摘要） 本文系统研究了影响辣椒组织培养的诸因素，建立了辣椒子叶的高频再生系统。以辣椒子叶为材料，通过与根癌农杆菌进行叶盘共培养建立了辣椒的遗传转化体系，并将反义磷脂酶D_γ基因转入辣椒。 1、辣椒再生体系的建立： （1）芽的诱导 根据前人的研究，我们以子叶为外植体，采用MS基本培养基，诱导辣椒芽分化。研究6-BA／IAA配比和GA₃、AgNO₃、苗龄、光暗处理、培养基pH、蔗糖浓度、叶片接种密度以及不同有机类型等因素对芽分化的影响。并对辣椒子叶培养中出现的褐化问题进行了探讨。结果表明，较高的6-BA／IAA配比有利于芽的分化。6-BA／IAA配比大于等于10并且6-BA浓度相对较高时，均可得到高于50％的出芽率。6-BA浓度对辣椒芽的分化影响很大。低浓度（3mg／L以下）的6-BA难以抑制根的分化。对辣椒的芽分化而言，加入一定量的IAA可促进芽的分化。在MS+6-BA5.5mg／L+IAA 0.5mg／L的培养基上，辣椒子叶芽分化率最高，达80％，由此确定该培养基为诱导芽分化的最适培养基。GA₃在芽分化中的作用较复杂。一方面，GA₃可缩短出芽的时间，使出芽时间提前3-5天，而且分化芽节间有明显的伸长。另一方面，GA₃降低了芽分化率（降至60％左右），诱导出的不定芽长势较差，生长困难。实验发现，加入硝酸银可缩短芽诱导所需时间1-2天，芽最初生长加快。低浓度硝酸银对芽的诱导影响不大，较高浓度的硝酸银对芽的诱导不利。本实验中无需加入GA₃和硝酸银。实验结果表明苗龄介于11—15天，叶片接种密度为10片／皿，蔗糖浓度为30g／L，出芽率最高，达80％以上。芽分化对pH有较大的适应范围，一定范围内pH的变化不会影响芽的再生。PH值为5.8对辣椒子叶芽的分化是适宜的。暗处理不利于辣椒的再生。较弱光照对辣椒芽分化有利，较强的光照对芽再生有一定程度的阻碍。光强以1000lux为宜。组织培养中常发生褐化现象，添加抗氧化剂还是采用改进措施，都能一定程度上减轻褐化现象，但不能从根本上解决褐化问题。在辣椒的组织培养中，选用酚类氧化物含量较低的品种十分关键。采用MS有机、B5有机和ZH有机均可获得较高的芽分化率和芽分化数。 （2）芽的伸长 辣椒再生中，最大的困难在于芽的伸长。激素组合（6-BA5mg／L，IAA0.4mg／L），芽生长旺盛的百分率最高，效果较理想，可基本满足芽正常生长对激素的需求。添加GA₃，浓度为4mg／L，芽伸长效果最好。最终确定（6-BA5.0mg／L，IAA0.4mg／L，GA₃ 4mg／L）为芽伸长的最适激素组合。ZH有机是在MS有机基础上，烟酸用量加倍，并添加叶酸和生物素而成。辣椒的芽伸长阶段，ZH有机上芽伸长率远远高于MS有机，说明ZH有机的确可促进了芽的正常伸长。最终确定最适的芽伸长培养基为MS盐+ZH有机+6-BA 5.0mg／L+IAA 0.4mg／L+GA₃4mg／L。芽伸长阶段，环境条件影响极大。环境条件主要包括培养基硬度和三角瓶中的空气湿度。琼脂用量为4.5g／L，采用塑料薄膜封口，可基本达到芽迅速伸长所需的环境条件，伸长效果明 山东农业大学硕士学位论文3 显。 （3）伸长芽生根 在辣椒芽的生根上，l／ZMS培养基优于 MS培养基，IAA优于 NAA，低浓度的 IAA优于高浓度的！AA。l厘MS培养基＋mAO．ling／L上生根效果较好，最终确定该 培养基为最适的生根培养基。 2、辣椒遗传转化体系的建立。 门)各因素对辣椒遗传转化的影响 结果表明：400rug／L的头抱霉素可有效抑制农杆菌的生长，同时对子叶的分化 影响不大。卡那霉素浓度为 20mg／L，辣淑芽的分化被完全抑制，芽分化率为 0％， 此浓度可作为选择压。处于对数生长期的农杆菌稀稀释到原浓度的l／2，侵染子叶5 分钟可获得较理想的效果，抗性芽再生率达20％。预培养卜 天能有效提高抗性芽 分化率。随着延迟选择时间的增加，转化再生率呈现先升后降的趋势，7天为最佳 延迟选择时间。共培养时间是影响转化率的重要因素。在固体培养基上共培养一大 抗性芽分化率最高，延长共培养时间，分化率呈下降趋势。 （2）辣椒遗传转化体系建立 外植体首先在芽分化培养基上预培芽2天，然后感染含有反义磷脂酶DY基因 的根癌农杆菌，放回原培养基中于暗处共培养 18－20 ，J＼时，除菌后移入附加 400mg／L 头抱霉素的芽分化培养培养基中培养 7天，之后移入附加 400mg／L头抱霉素，20mg／Lg／L 卡那霉素的芽分化培养基中进行选择培养，转化芽在含有相同浓度的头抱霉素和卡 那霉素的伸长培养基中伸长至2－3cm时，移入含与上相同浓度的头抱霉素和卡那霉 素的生根培养基中生根。 3、转基因植株的检测。 对辣椒转化植株的检测主要采用PCR方法。以抗性植株的总DNA为模板，以 质粒DNA为阳性对照，以未转基因植株为阴性对照，