目的:巨噬细胞是抗感染的重要力量，通过其表面模式识别受体（PRR）识别细菌表面的病原相关分子模式（PAMPs）而活化，TLR是重要的PRR，可以识别结合多种病原菌成分而活化巨噬细胞。当TLR与PAMPs结合后，受体发生二聚体化，招募MyD88分子，MyD88分子中的DD结构域招募其下游的IRAK并活化，从而激活TRAF6，引起NF-κB活化。被活化的NF-κB转位至细胞核内,与DNA序列上的特异蛋白结合，诱导特定基因mRNA转录，翻译产生蛋白质。巨噬细胞的活性还受到多种负调控蛋白的影响，其中细胞因子信号抑制蛋白（suppressor of cytokinesignaling，SOCS）即为可调节免疫细胞活化、以保证免疫应答适可而止的重要分子。在许多免疫细胞中都已发现SOCS巨大的负反馈调节作用。SOCS由至少8种成分组成，即SOCS1-7和CIS。其中，SOCS-1主要通过细胞因子-细胞因子受体结合，进而激活JAK/STAT途径产生。已有资料表明，一些细胞因子的活化，如IFN-，IL-10，IL-2和集落刺激因子都可以诱导SOCS-1的产生，其中干扰素受体途径是其激活的经典途径，当干扰素和其位于细胞表面的干扰素受体结合后，激活受体相关的酪氨酸激酶（JAK-1and TyK2），随后STAT1被磷酸化激活，并转位入核，活化SOCS-1靶基因，表达SOCS-1蛋白。近几年有资料报道，SOCS-1还可以通过TLR，Dectin-1等通路被诱导产生，LPS、CpG、酵母多糖等是它的刺激剂。目前，越来越多的研究提示，微生物及寄生虫的成分可以诱导SOCS蛋白的产生，并以此下调免疫应答反应，从而逃避机体的免疫攻击。A群链球菌（GAS）可以导致咽炎、软组织感染和其他许多呼吸道感染。GAS感染可以激活巨噬细胞膜表面的TLR2、TLR4等模式识别受体，诱导炎症细胞因子IL-1，IL-6和TNF-α及IFN-等产生，但GAS之所以能在人群中持续存在并引起一些严重的感染性疾病，与其具有逃避宿主免疫攻击的能力密切相关，一个常见的现象就是GAS感染的严重坏死部位的一线防御细胞数量极少。因此为了进一步了解GAS下调炎症因子的分泌的策略，从而探索SOCS-1的产生机制，因此，我们进行了以下实验：1、检测GAS感染小鼠巨噬细胞初期SOCS-1蛋白的表达情况。2、鉴于细胞因子受体活化通路是诱导SOCS-1的经典通路，通过放线菌酮（抑制真核细胞蛋白质合成）作用于巨噬细胞再行GAS感染，以此检测细胞因子对于SOCS-1产生的影响。3、细胞因子IFN-活化通路是诱导SOCS-1的经典通路,因此，用IFN-特异性中和抗体进行阻断，以此验证IFN-在GAS感染诱生SOCS-1蛋白发挥的作用。4、另外，已有许多研究证明通过TLR途径可以直接诱导SOCS-1的表达，但其机制并不清楚。因此，我们检测了GAS感染小鼠巨噬细胞后，细胞表面TLR2和TLR4的活化情况，进而研究TLR信号通路与SOCS-1产生的关系。5、利用抑制剂、基因敲除鼠等手段研究TLR4、MYD88、NF-κB等关键节点蛋白在GAS诱导SOCS-1产生中的作用。6、鉴于NF-κB是一种多向性基因调控蛋白，调节多种参与免疫反应及免疫相关分子的基因转录过程，因此，通过对NF-κB活性的阻断研究以此证明NF-κB在SOCS-1表达中的调控作用。本研究丰富了对细菌与免疫细胞相互作用方式、机制的认识，特别是丰富了对微生物诱发宿主细胞快速的、直接的表达负调控因子进行逃逸固有免疫机制的了解，有助于拓宽抗感染免疫措施的建立与发展。方法:1A族链球菌以MOI100:1感染鼠巨噬细胞RAW264.7小鼠骨髓来源BMDMs，诱导产生SOCS-1的特征。2放线菌酮处理巨噬细胞后感染GAS菌株，初步确定GAS诱导产生SOCS-1与细胞因子途径的关系。2.1检测GAS组，热灭活GAS组的细胞因子IFN-表达情况（实时定量PCR进行检测）。2.2用IFN-的特异性抗体阻断其活化后，检测JAK/STAT通路及SOCS-1的产生情况。2.3放线菌酮提前作用巨噬细胞30分钟后，加入GAS作用1小时后，去除GAS，在放线菌酮作用下继续培养6小时，通过RT-PCR，Western blot检测SOCS-1的产生情况，以及JAK/STAT通路的活化情况。3确定GAS感染巨噬细胞引起SOCS-1表达与巨噬细胞TLR4受体的关系。3.1检测GAS组，热灭活GAS组的模式识别受体TLR2/TLR4表达情况（实时定量PCR进行验证）。3.2以TLR4特异性阻断剂提前30分钟作用巨噬细胞后，GAS MOI100：1感染巨噬细胞1小时，去除细菌，在特异性阻断剂存在的情况下继续培养6h后检测JAK/STAT通路的活化及SOCS-1的表达情况。3.3分离TLR4基因敲除鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),重复以上实验验证TLR4与SOCS-1产生的关系。4确定GAS诱导SOCS-1高表达与TLR4/MyD88传导通路的关系。4.1通过免疫荧光及免疫共沉淀技术检测巨噬细胞中MyD88，JAK1，STAT1蛋白存在的状态。4.2根据以上结果，在确定MyD88分子和JAK1，STAT1在巨噬细胞中以复合物的形式存在的前提下，用GAS感染时，用免疫荧光和免疫共沉淀的方法检测这个复合物被活化的情况。4.3用放线菌酮去除细胞因子的作用后，用免疫共沉淀的方法验证TLR4/MyD88直接通路的存在。4.4分离MYD88基因敲除鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），GAS感染，进一步确证TLR4/MyD88直接通路的存在。5NF-κB活化对GAS诱导的SOCS-1表达中的影响作用研究5.1小鼠巨噬细胞感染GAS后，经过1h，2h，4h，6h检测NF-κB活化情况，并同时检测JAK/STAT通路蛋白的表达及活化情况，初步确定JAK/STAT通路的活化与NF-κB活化的关系。5.2根据以上结果，利用NF-κB活化的特异性阻断剂阻断后，检测JAK/STAT通路上JAK，STAT蛋白的表达及活化情况，以及SOCS-1的表达情况。结果:1GAS感染巨噬细胞早期诱导SOCS-1大量表达以MOI100：1菌量的A族链球菌（GAS）、热灭活的GAS（nonviableGAS）分别刺激小鼠来源的巨噬细胞系RAW264.7和BMDMs1小时，SOCS-1的表达特征：GAS感染RAW264.7巨噬细胞后2小时SOCS-1基因开始有明显的升高，6小时达到高峰，8小时开始下降；同时对照组热失活GAS刺激RAW264.7巨噬细胞SOCS-1mRNA则在感染过后6-8小时开始轻度升高，且升高的幅度明显小于GAS组。在GAS感染BMDM细胞时，SOCS-1mRNA的表达情况基本和RAW264.7细胞一致，只是反应的强度大于RAW264.7细胞。Western Blot检测GAS引起SOCS-1蛋白在感染6小时后开始表达，而热灭活得GAS基本在10h内没有表达。2GAS感染小鼠巨噬细胞早期引起SOCS-1表达部分依赖于细胞因子IFN-β途径2.1GAS感染RAW264.7细胞2小时IFN-β开始升高，6小时达到高峰。2.2通过anti-IFN-β与GAS共培养，检测SOCS-1，结果表明，IFN-β活化途径可以引起SOCS-1的产生，但其并不是唯一途径。2.3为了检测是否为其他细胞因子活化引起SOCS-1的表达，加入放线菌酮(抑制真核细胞蛋白质的翻译,阻断细胞因子分泌)共培养，结果表明加入CHX后STAT1依然能被磷酸化活化，表明GAS感染诱导SOCS-1表达产生除了部分依赖于细胞因子活化外，还存在一条直接刺激巨噬细胞产生SOCS-1的途径。3GAS感染巨噬细胞后TLR4活化情况GAS感染RAW264.7细胞后，位于细胞膜表面的TLR2和TLR4被活化。在感染发生后4小时，TLR4的表达升高到了峰值，为正常的8倍左右，在感染后6小时其表达开始下降；而对照组热灭活处理的GAS感染巨噬细胞6小时内TLR4的表达没有升高；而细胞膜表面的TLR2在感染发生6小时内GAS组和热失活GAS组基本没有区别，都在感染后4小时达到峰值，并且升高幅度基本一致。4TLR4参与了GAS感染引起的SOCS-1的表达4.1为了确定巨噬细胞表面TLR4的激活是否参与了SOCS-1的表达，我们用TLR4的中和抗体提前封闭巨噬细胞表面的TLR4，再行GAS感染，结果显示，封闭巨噬细胞TLR4后， GAS感染引起的SOCS-1表达量明显降低，由此证明位于巨噬细胞表面TLR4在GAS感染引起SOCS-1表达方面发挥了重要作用。4.2GAS感染TLR4-/-小鼠BMDMs细胞，结果进一步证实了TLR4在诱导SOCS-1表达中发挥的重要作用。5SOCS-1表达呈MyD88分子依赖性5.1免疫荧光染色和免疫共沉淀结果表明，在RAW264.7细胞中MyD88，JAK1，STAT1是以复合体的形式存在的。当GAS感染发生后，与MyD88结合的JAK1蛋白迅速发生磷酸化，在感染后1-2小时达到高峰，随后复合物中的STAT1开始发生磷酸化激活，在3小时达到峰值。5.2GAS刺激MyD88-/-BMDMs细胞，检测发现SOCS-1表达缺失。5.3CHX阻断细胞因子后，进行免疫共沉淀实验，结果证实结合于MyD88分子上的STAT1依然被活化，由此进一步证明了感染早期，GAS本身可以通过直接激活结合于MyD88分子上的STAT，从而引起SOCS-1蛋白的快速表达。6NF-κB信号通路通过调控STAT1表达影响SOCS-1蛋白6.1GAS刺激巨噬细胞后，引起NF-κB被活化及STAT1蛋白表达增加，且STAT1表达增加落后于NF-κB的活化，说明NF-κB的活化可能影响STAT1的表达。6.2通过NF-κB信号通路阻断剂JSH-23作用后检测发现,STAT1的表达明显降低，进而磷酸化STAT1及SOCS-1蛋白的表达水平大大降低。结论:1GAS感染巨噬细胞早期可诱导SOCS-1蛋白大量表达。2GAS感染小鼠巨噬细胞引起SOCS-1表达部分依赖于IFN-活化通路。3TLR4/MyD88直接通路在GAS感染早期诱导表达SOCS-1中起重要作用。4NF-κB信号通路通过调控JAK1/STAT1通路中STAT1蛋白的表达水平进而影响SOCS-1蛋白的表达