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猪塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属成员,可导致育肥猪鼻镜及蹄部出现水疱,仔猪急性死亡和腹泻。本研究利用PK-15细胞从猪水泡液和组织研磨液中成功分离出四株SVA(CH-DB-11-2015、CH-LX-01-2016、CH-ZW-01-2016、CH-DL-01-2016),并对其和本实验室保存的三株SVA进行全基因组序列测定及分析。选用PK-15细胞作为模型,利用高通量测序技术和基因芯片技术筛选了PK-15细胞感染SVA后的差异表达micro RNAs(mi RNAs)和messenger RNA(m RNA),并对差异表达mi RN A和差异表达基因进行GO和KEGG分析,分析差异mi RNA和差异基因在抵抗SVA天然免疫中的功能。同时利用荧光定量RT-PCR、Western Blot和液相芯片技术检测SVA感染后9个时间点信号转导因子m RNA转录水平、干扰素的表达量和细胞因子的浓度。研究结果如下:(1)SVA遗传进化分析结果表明四株SVA和实验室之前分离的三株SVA(CH-01-2015、CH-02-2015和CH-04-2015)位于Senecavirus病毒属的大分支上,且与加拿大毒株11-55910-3和SVV-001的亲缘关系较远,相似性分别为96.4–96.7%和94.2–94.4%。其中CH-02-2015和CH-04-2015与美国毒株的同源性较高,而其余五株SVA则与三株巴西毒株的同源性较高。(2)PK-15细胞感染SVA前后小RNA测序分析分别构建了对照组和接毒组的PK-15细胞小RNA文库,并利用高通量测序技术对2个小RNA文库进行了测序,分析mi RNA在PK-15细胞感染SVA前后的表达模式。结果显示37个mi RNA显著上调表达,63个mi RNA显著下调表达。对这100个差异表达的mi RNA的靶基因进行预测,结果获得了11469个靶基因转录本,这些靶基因主要富集到代谢通路、B细胞受体信号通路和癌症相关通路等。同时预测新miRN A,254个新miRNA显著上调表达,而仅有4个新miRNA显著下调表达。(3)PK-15细胞感染SVA前后m RNA表达谱分析利用基因芯片技术研究PK-15细胞感染SVA前后m RNA表达谱,结果显示SVA感染后678个基因显著上调表达,637个基因显著下调表达。对差异表达基因进行GO分析,发现差异表达基因主要参与到炎症反应、病毒防御反应等。KEGG分析结果显示差异表达基因主要富集到免疫相关通路,例如Toll样受体信号通路、胞内DNA传感途径等。利用荧光定量RT-PCR检测SVA感染PK-15细胞9个时间点23个基因的m RNA转录水平,结果显示接毒组细胞的IRF7、IFN-β、STAT1、STAT2、IRF9、OAS、PKR、Mx1 m RN A转录水平显著增高(4)mi RNA–m RNA关联分析对SVA感染后差异表达的mi RNA,以及1315个差异表达的m RNA进行免疫相关的关联分析,结果表明ssc-mi R-296-3p、ssc-mi R-339、ssc-mi R-339-5p、ssc-mi R-4334-3p、ssc-mi R-149、ssc-mi R-1306-5p、ssc-mi R-532-3p、ssc-mi R-744以及54个新mi RN A参与到TLR、RLR和N LR介导的信号通路、JAK-STAT信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等天然免疫应答过程,这些mi RNAs可能在SVA感染的发病机制中起关键作用。(5)SVA感染后对I型干扰素和细胞因子表达的影响Western Blot实验结果显示SVA感染细胞后IFN-β蛋白大量表达;液相芯片结果显示SVA感染早期细胞能诱导IFN-α、IL-6、IL-8大量分泌,而IL-1β、IL-4和IL-12在感染后24h开始大量分泌;以上这些试验结果表明SVA感染能激活机体的天然免疫,诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的表达。