丹顶鹤卷棘口吸虫的分子鉴定与线粒体基因组序列分析

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丹顶鹤(Grus japonensis)是世界上濒临灭绝的珍稀鸟类之一,已被列为我国一类重点保护鸟类。其主要以淡水鱼虾为食,极易感染各种吸虫,尤其是卷棘口吸虫(Echinostoma revolutum)。卷棘口吸虫是家禽和野禽常见的寄生虫之一,也可感染人类,属于人兽共患的多宿主寄生虫。丹顶鹤感染该虫后可引起食欲不振、下痢、消瘦和生长发育受阻等症状,严重感染可导致死亡。目前国内外对该虫的研究仅有形态学和流行病学相关报道。本论文对丹顶鹤卷棘口吸虫进行了形态学和分子生物学鉴定,采用长PCR方法扩增该虫线粒体全基因组序列并进行了序列分析。首先,采用镜检法对经硼砂卡红染色后的虫体进行形态观察;参考NCBI上公布的棘口科ITS序列设计引物,上游引物ERF:5′-AGGAGACTTGGGCTACGGCT-3′和下游引物ERR:5′-CGATAGAGTGACAGTAACGGAACG-3′,对该虫r DNA ITS序列进行PCR扩增和序列分析。结果显示该虫形态特征与卷棘口吸虫一致,其扩增片段为710 bp,与Gen Bank数据库中E.revolutum(GQ463130)的同源性最高(99%),系统进化树显示该虫与E.revolutum位于同一分支,确定该虫为卷棘口吸虫。其次,采用长PCR方法扩增E.revolutum线粒体全基因组序列。结果显示其长度为15714 bp,含有36个基因(12个蛋白编码基因、22个t RNA基因和2个r RNA基因)和1个非编码区(NCR),其碱基含量为A+T=61.73%,密码子使用偏好A和T。12个蛋白编码基因中nad4L基因AT含量最高(66.26%),atp6基因最低(59.73%)。起始密码子为GTG和TTG,终止密码子为TAA和TAG。22个t RNA基因大小为59~70 bp,二级结构为典型的三叶草结构和D-loop结构。rrn L和rrn S基因大小分别为1011 bp和742 bp。最后,将E.revolutum线粒体基因组与Gen Bank公布的E.miyagawai和E.hortense进行比较分析。结果显示3种棘口吸虫线粒体基因组均由36个基因和1段非编码区组成,E.revolutum基因组最长(15714 bp),E.miyagawai最短(14416 bp);nad4L和nad4基因之间均存在38 bp的重叠区,t RNA-Glu基因后存在长片段的非编码区;所有基因的碱基组成具有AT偏好;12个蛋白编码基因中atp6基因ka/ks值最大(7.72),cox1最小(0.33)。系统进化树显示E.revolutum和E.miyagawai聚为一支,与似锥低颈吸虫聚为棘口科分支。分体科、片形科、背孔科、前后盘、并殖科、后睾科、异形科和曲口科各自形成独立的分支,表明其属于不同的进化群。综上所述,本论文对丹顶鹤卷棘口吸虫进行了分子鉴定,并对其线粒体全基因组序列进行了解析,不仅丰富了棘口属吸虫的线粒体基因组数据库,为比较基因组学研究提供了重要资料,而且还为阐明棘口科吸虫之间的遗传多样性提供了科学依据。
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