目的:通过研究罗格列酮(Rosiglitazone, ROZ)对结肠癌细胞SW480的体外作用,观察罗格列酮联合抗癌药物氟尿嘧啶(5-FU)对SW480细胞体外作用的影响,进一步探讨ROZ抑制肿瘤细胞增殖及凋亡的可能机制,为寻求结肠癌治疗的新的药物提供理论依据。方法:1体外培养人结肠癌细胞SW480,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(tetrzolium-based colorimetric assay, MTT)测定ROZ对该细胞增殖的抑制作用,选择合适的实验剂量;采用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率;普通光学显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)半定量检测ROZ诱导人结肠癌细胞凋亡过程中相关蛋白PTEN、VEGF的表达情况。应用免疫组化法检测各组细胞中PPARγ、PTEN、VEGF蛋白的表达情况。2采用MTT比色法检测罗格列酮与抗癌药物氟尿嘧啶联合应用对人结肠癌细胞SW480的增殖抑制作用;采用金氏公式[1]分析相互指数(Intrtaction Index),评价联合后的作用,如q>0.85表示相加作用,q<0.85为拮抗作用。结果:1. 1MTT检测结果显示,罗格列酮(12.5、25、50、100μmol/L )ROZ对SW480细胞增殖具有抑制作用。不同浓度ROZ处理细胞24~72h后,与对照组相比,各实验组OD值均有不同程度下降,差异有显著性(P<0.01)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.01),随着ROZ处理浓度的增加、作用时间的延长,OD值逐渐下降。ROZ对SW480细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。抑制率以100μmol/L ROZ作用72h为最高,可达66.7%。1.2流式细胞仪检测结果显示: 0、12.5、25、50μmol/L作用SW480细胞48h后,随药物浓度增加,G0/G1期细胞逐渐增多,S期细胞逐渐减少。提示ROZ可阻滞SW480细胞周期于G0/ G1期,该作用有剂量依赖性。0、12.5、25、50μmol/L ROZ作用细胞48h后,凋亡百分率分别为:3.76%、7.55%、20.54%、31.85%。流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰,凋亡率随ROZ浓度增加而逐渐升高。各处理组的凋亡率与对照组相比,有显著性差异(P<0.01)。1.3光镜下观察细胞形态变化,结果显示:未经药物作用的细胞形态多样,有圆形、梭形及多边形,形态饱满,药物作用后细胞皱缩、破裂,有的细胞两端出现细长的伪足,细胞胞浆中出现空泡,脱落细胞增多。1.4透射电镜下观察细胞超微结构发生改变:细胞体积缩小,微绒毛数量减少,核膜皱缩,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜收缩的新月状小体,有的出现核固缩。1.5流式细胞仪半定量检测SW480细胞中PTEN、VEGF蛋白表达,结果显示:0、12.5、25、50μmol/L ROZ作用SW480细胞48h后,各组VEGF蛋白的荧光指数FI值均随处理组药物浓度增大而逐渐降低。PTEN蛋白的荧光指数FI值随处理组药物浓度增大而逐渐增大。对于每一种蛋白,比较其处理组和空白对照组的FI值,均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。1.6免疫组化检测结果显示:PPARγ、PTEN蛋白表达于细胞胞浆,VEGF蛋白表达于细胞胞浆和血管内皮细胞,可见棕黄色着色。按照IHS值法进行免疫组化评分。VEGF各组蛋白表达值(IHS值)随ROZ剂量的增大而逐渐减小,PPARγ、PTEN各组蛋白表达值(IHS值)则随药物剂量的增大而逐渐增加。对于每种蛋白,比较其处理组和阴性对照组的IHS值,均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。2.MTT比色法分析ROZ联合5-FU对SW480细胞的增殖抑制作用,结果显示:12.5、25、50μmol/L的罗格列酮可加强氟尿嘧啶对SW480细胞的增殖抑制作用,二者联合用药对SW480细胞的增殖抑制率比单独应用5-FU和ROZ对细胞的增殖抑制率增强。且随ROZ浓度的增大,其对5-FU的协同作用增强。金氏公式分析相互作用指数显示,不同浓度5-FU联合12.5、25、50μmol/L ROZ的q值均大于0.85。结论:1 ROZ在一定剂量范围内能抑制结肠癌细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性。2 ROZ抑制结肠癌细胞生长与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G0/ G1期有关,该作用呈一定的剂量依赖性。3 ROZ抗结肠癌作用机制可能与其下调VEGF蛋白,上调PPARγ、PTEN蛋白的表达有关。4 ROZ具有抑制结肠癌细胞增殖及诱导其凋亡的作用,为结肠癌治疗提供了新的思路和实验依据。5 ROZ可与5-FU协同抑制SW480细胞的增殖作用。