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1目的茉莉酸类(jasmonates, JAs)是一类植物激素,重要的伤信号分子,在植物的防御反应中起至关重要的作用。JAs能够诱导植物产生次生代谢产物,提高植物的抗逆性,增强对病害虫的防御能力。本项目旨在对JAs生物合成中特异性酶——丙二烯氧合酶基因(AOS)进行克隆,采用农杆菌介导的方法转化广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.),获得转AtAOS基因植株,以得到广谱抗病虫和高药效成分含量的转基因广藿香品系。2方法2.1目的基因的克隆2.1.1目的基因的克隆根据Genebank公布的AtAOS(AY128755)序列,设计特异性RT-PCR引物,以哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,得到AtAOS基因片段。2.1.2克隆质粒的构建将RT-PCR产物回收,纯化后连接T载体(pDriver Cloning vector或pGEM-T easy等),转化E.coli DH5α感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性进行蓝白筛选,并通过酶切、测序等方法筛选和鉴定阳性重组子。2.2广藿香再生体系的建立2.2.1愈伤组织的诱导以MS为基础培养基,添加生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichiorophenoxyacetic; 2,4-D)和细胞分裂素激动素(kinetin; KT),以筛选广藿香愈伤组织最佳诱导条件。2.2.2再生植株的诱导和愈伤组织的分化以MS为基础培养基,添加细胞分裂素苄基腺嘌呤(6-benzyladenine; 6-BA),筛选广藿香丛芽再生的最佳诱导条件及愈伤组织的分化条件。2.2.3抗生素浓度条件的确定以广藿香愈伤组织诱导培养基为基础,添加羧苄青霉素(carbenicillin; Carb),设置不同的浓度,对广藿香进行选择压力的筛选。以得到广藿香再生植株最大耐受程度时的羧苄青霉素浓度。2.3丙二烯氧合酶(AtAOS)转化广藿香2.3.1植物表达载体的构建2.3.1.1表达质粒的构建对携带AtAOS基因片段的克隆质粒pGEM-AtAOS(pA)进行酶切处理,电泳分离、回收、纯化得到粘性末端目的DNA片段,连接到相同酶切处理并经过CIAP去磷酸化处理的植物表达载体pBI121,将重组子转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5a,通过Carb抗性筛选阳性克隆,并通过酶切、测序等方法筛选和鉴定阳性重组子。2.3.1.2表达质粒电击转化农杆菌EHA1 05将重组表达质粒与农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105感受态细胞混合,加到电击仪的电击杯中,选择Agr程序进行电击。将经电击转化的菌液涂布于抗性YEB平板,通过氯霉素及卡那霉素抗性筛选阳性重组子,并通过PCR法检测,确定阳性重组转化子。保存含阳性重组子菌液。2.3.2广藿香叶片的预培养将广藿香叶片在再生植株分化培养基上,设置不同预培养天数,以得到广藿香叶片转化时的最佳转化状态。2.3.3目的基因的转化将携带表达质粒的农杆菌培养至对数期,经稀释后侵染广藿香愈伤组织及预培养后的叶片。经过2天暗培养后,转移至抗生素筛选分生培养基上进行光照培养。2.3.4转基因再生植株的检测提取转基因再生植株叶片的DNA和RNA,对各植株分别进行目的基因(AtAOS)、GUS基因PCR扩增,对AtAOS基因进行RT-PCR扩增；对已筛选的愈伤组织及转化植株进行组织化学法染色,最终确定转基因再生植株。3结果3.1 AtAOS基因的克隆3.1.1 AtAOS的RT-PCR扩增根据琼脂糖凝胶电泳结果,RT-PCR产物与预期一致,可初步判断成功扩增AtAOS基因片段,长度为1.6 kb。3.1.2克隆质粒的构建通过蓝白筛选及菌落PCR法鉴定、琼脂糖凝胶电泳和测序等方法筛选鉴定阳性重组子。结果表明：成功构建携带AtAOS基因的克隆质粒pGEM-AtAOS (pA)。通过序列比对,在重组克隆质粒pGEM-AtAOS(pA)中,AtAOS基因核苷酸序列与Genebank登记的Arabidopsis thaliana allene oxide synthase基因序列(序列号为AY1 28755)一致性为100%(1645 bp／1645 bp),包含了目的基因全部的编码序列。3.2广藿香再生体系的构建3.2.1愈伤组织的诱导以肇庆广藿香试管苗的叶片为外植体材料,成功诱导出愈伤组织,并考察了不同植物激素浓度组合对愈伤组织诱导的影响差异,最佳愈伤组织诱导培养基为MS+KT(0.5 mg／L)+2,4-D(0.05 mg／L)。3.2.2再生植株的诱导和愈伤组织的分化分别以肇庆广藿香试管苗的叶片及诱导成功的愈伤组织为材料,均在分化培养基上成功诱导出广藿香再生植株,分化培养基确定为MS+6-BA(1 mg／L)。3.3丙二烯氧合酶转化广藿香体系的构建3.3.1表达质粒的构建PCR法检测单菌落克隆,琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明,成功构建携带AtAOS基因的表达质粒pGEM-AtAOS-pBI(pAp),ORF正确,编码518个氨基酸,与Genebank中AtAOS氨基酸序列(登记号为AAM91155.1)同源性为100%(518 aa／518 aa)。3.3.2抗生素浓度条件的确定将不同浓度的Carb加到愈伤组织诱导培养基MS+KT(0.5 mg／L)+2,4-D(0.05 mg／L)中,对肇庆广藿香叶片外植体进行选择压耐受性筛选,确定外植体对Carb的最大耐受浓度为500 mg／L。3.3.3广藿香叶片的预培养根据广藿香叶片侵染后的生长状况,得出广藿香叶片的预培养时间为2天。3.3.4侵染、抗生素筛选将对携带重组表达质粒的农杆菌培养至对数期,稀释1-20倍后,对预培养的广藿香叶片及愈伤组织进行不同时间侵染处理,根据各组织材料在筛选培养基上(MS+KT 0.5 mg／L+2,4-D 0.05 mg／L+Carb 500 mg／L+Kan 75 mg／L)的生长状态,确定侵染条件为：农杆菌菌液稀释5-10倍,侵染时间为15 min时效果最佳。由于Kan对愈伤组织诱导的抑制作用比较明显,在筛选方法上进行改良,即先通过双抗筛选后,解除Kan的抑制,继续在单抗生素即羧苄青霉素筛选培养基(MS+KT 0.5 mg／L+2,4-D0.05 mg／L+Carb 500 mg／L)中进行培养、筛选。3.3.5转基因再生植株的检测对142株转基因植株叶片AtAOS进行PCR扩增,从其中3株中均得到与预期片段大小一致的产物；后对GUS进行PCR扩增、对AtAOS进行RT-PCR扩增,也得到与预期片段大小一致的产物。筛选后的愈伤组织经过组织化学法染色后出现明显的蓝色,转化植株染色结果不明显,检测结果表明,已成功地将目的基因转化进广藿香植株,并得到表达。4结论成功克隆AtAOS基因,并连接至植物表达载体pBI121；成功构建了表达质粒pGEM-AtAOS-pBI(pAp)；并已获得3株转基因广藿香植株。