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高脂血症是动脉粥样硬化性心血管疾病的一个重要危险因素,高脂血症促进动脉粥样硬化的发生发展,增加斑块的不稳定性,动脉粥样硬化斑块破裂又可以导致血管内血栓形成,阻塞血液流动,并导致心肌梗死和中风的形成。其中血浆低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)又在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键作用,降低血浆LDL-C能减少动脉粥样硬化性心血管事件的发生。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)能有效地与肝细胞膜上低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor, LDLR)结合,使其进入胞内溶酶体降解,减少LDLR介导的胆固醇清除,进而增加血浆LDL-C。PCSK9抑制剂被认为是继他汀类药物后新一代的降脂药物。MicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNA,在哺乳动物体内主要通过与靶序列结合,在转录后水平抑制基因的表达。与机体内的正常新陈代谢、疾病的发生发展关系密切。miRNAs在脂质代谢调控中发挥着重要作用,被认为是治疗干预中潜在的新靶点。
目的:探讨miR-224-5p对PCSK9的表达以及对HepG2细胞摄脂能力的影响。
方法:运用生物信息学的方法对miR-224-5p基因位置、保守性、种子序列进行分析。在Targetscan、miRanda、miRDB、RNAhybrid等多个数据库分析miR-224-5p与PCSK9结合位点及结合自由能。双荧光素酶报告基因验证miR-224-5p与PCSK9mRNA3’UTR直接靶向结合。Westernblot检测miR-224-5pmimic和miR-224-5pinhibitor对PCSK9和LDLR蛋白的影响,细胞免疫荧光直接观察细胞膜上的LDLR。油红O染色和DiI-LDL分别观察miR-224-5p对HepG2细胞细胞脂滴含量和脂质摄取能力的影响。
结果:生物信息学分析发现人的miR-224-5p基因定位于Xq28,不同物种间高度保守。miR-224-5p与PCSK9mRNA3’UTR存在靶向结合的基础,结合自由能较低。双荧光素酶报告基因显示,miR-224-5pmimic能抑制PCSK9-WT3’UTR荧光素酶活性,而对PCSK9-Mut3’UTR没有抑制作用,表明PCSK9mRNA3’UTR是miR-224-5p的靶点。进一步实验发现miR-224-5pmimic能够明显抑制PCSK9蛋白表达,增加LDLR蛋白含量。miR-224-5p下调后则表现为PCSK9表达增加,细胞LDLR水平降低。此外,油红O染色可见miR-224-5pmimic组内的脂滴明显减少,miR-224-5pinhibitor组内的脂滴明显增多。miR-224-5p高表达后明显促进HepG2细胞对LDL-C的摄取。
结论:
1.miR-224-5p靶向结合PCSK9mRNA3’UTR,抑制PCSK9表达。
2.miR-224-5p降低HepG2细胞内脂滴含量,增加HepG2细胞对脂质的摄取。
目的:探讨miR-224-5p对PCSK9的表达以及对HepG2细胞摄脂能力的影响。
方法:运用生物信息学的方法对miR-224-5p基因位置、保守性、种子序列进行分析。在Targetscan、miRanda、miRDB、RNAhybrid等多个数据库分析miR-224-5p与PCSK9结合位点及结合自由能。双荧光素酶报告基因验证miR-224-5p与PCSK9mRNA3’UTR直接靶向结合。Westernblot检测miR-224-5pmimic和miR-224-5pinhibitor对PCSK9和LDLR蛋白的影响,细胞免疫荧光直接观察细胞膜上的LDLR。油红O染色和DiI-LDL分别观察miR-224-5p对HepG2细胞细胞脂滴含量和脂质摄取能力的影响。
结果:生物信息学分析发现人的miR-224-5p基因定位于Xq28,不同物种间高度保守。miR-224-5p与PCSK9mRNA3’UTR存在靶向结合的基础,结合自由能较低。双荧光素酶报告基因显示,miR-224-5pmimic能抑制PCSK9-WT3’UTR荧光素酶活性,而对PCSK9-Mut3’UTR没有抑制作用,表明PCSK9mRNA3’UTR是miR-224-5p的靶点。进一步实验发现miR-224-5pmimic能够明显抑制PCSK9蛋白表达,增加LDLR蛋白含量。miR-224-5p下调后则表现为PCSK9表达增加,细胞LDLR水平降低。此外,油红O染色可见miR-224-5pmimic组内的脂滴明显减少,miR-224-5pinhibitor组内的脂滴明显增多。miR-224-5p高表达后明显促进HepG2细胞对LDL-C的摄取。
结论:
1.miR-224-5p靶向结合PCSK9mRNA3’UTR,抑制PCSK9表达。
2.miR-224-5p降低HepG2细胞内脂滴含量,增加HepG2细胞对脂质的摄取。