肿瘤免疫治疗是利用免疫学原理和方法,对机体本身的免疫功能进行激发和增强,从而达到杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的效果。目前研究免疫疗法对抗癌症的方法中较有进展的是单克隆抗体疗法、癌症疫苗疗法和免疫细胞疗法。在2013年的<《科学》杂志上,肿瘤免疫治疗被评为年度十大科学进展的第一位。然而,尽管机体有多种抗肿瘤免疫应答,但肿瘤仍可在体内发生、发展,并且随着肿瘤的增长,肿瘤细胞能产生一些细胞因子。这些因子可以诱导机体产生一些抑制免疫的细胞,从而抑制抗肿瘤的免疫功能。免疫抑制细胞包括未成熟的树突状细胞(iDC)、肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg).具有生物活性的鞘脂类代谢产物,特别是神经酰胺(Cer),鞘氨醇(Sph)和1-磷酸鞘氨醇(S1P),作为重要的生物效应分子,参与调节信号转录,引起细胞增值或死亡。近年来关于神经酰胺类似物的研究发展较迅速,人们发现多种神经酰胺类似物在抗肿瘤研究中存在较大潜力。但是这些类似物在肿瘤免疫抑制细胞中的作用机制是十分不清楚的。本论文从体内和体外环境下,考察神经酰胺类似物对肿瘤免疫抑制细胞的作用,并探究这一过程中比较完善的信号传导途径,这可能为进一步深入阐明神经酰胺类似物在肿瘤免疫逃避中的作用机制提出新的观点,并可能为研发针对肿瘤免疫抑制细胞为靶点的治疗方法提供理论依据和实验基础。本文的主要研究结论如下：1.荷瘤小鼠中CD11b+ Gr1+MDSCs的比例升高,促进肿瘤的发生和发展。转移性肉瘤细胞CMS4-met接种在BALB/c小鼠的皮下,一个月后,经过流式细胞仪检测分析,与未接种肿瘤的空白对照组相比,实验组小鼠脾细胞、骨髓细胞和血细胞中CD11b+ Gr1+MDSCs细胞比例明显提高。这表明肿瘤相关的免疫抑制细胞的增加会促进肿瘤的发生和发展。2.神经酰胺类似物LCL521在动物模型中降低了脾和肿瘤组织中CDllb+Gr1+MDSCs的百分比,抑制肿瘤的生长。转移性肉瘤细胞CMS4-met接种在BALB/c小鼠的皮下,一个月后,静脉注射LCL521 (75mg/kg.bw)两次,每隔一天一次,采集得到荷瘤小鼠对照组和给药组的脾细胞、肿瘤细胞、骨髓细胞和血细胞,流式细胞仪检测分析CD11b+ Gr1+MDSCs的含量变化。结果显示：相比对照组,给药组中脾组织和肿瘤组织的MDSCs细胞百分比明显减少,表明在小鼠体内实验中LCL521明显降低MDSCs的含量。具有60-70mm3大小肿瘤的荷瘤小鼠在施加LCL521药物作用7天(1次／天,共6次)后,给药组肿瘤体积能有效得到抑制,表明LCL521对肿瘤的生长也起到有效得到抑制作用。3.J774和RAW两种细胞可以分别作为MDSCs和巨噬细胞的体外模型。流式细胞仪检测分析表明J774细胞绝大部分表现出CD11b、Gr1双阳性,而RAW主要是CD11b阳性而Grl阴性。故我们采用J774作为CDllb+Grl+MDSCs的体外细胞模型,而RAW则作为巨噬细胞的体外模型,用于研究神经酰胺类似物对肿瘤相关的免疫抑制细胞的作用及其分子机制。4.神经酰胺类似物LCL521诱导J774、RAW细胞死亡排除了凋亡、程序性细胞死亡、细胞自噬的可能途径。采用PI染色检测,结果显示LCL521引起J774、RAW这两种细胞浓度依赖性的死亡。为了进一步探究LCL521诱导细胞细胞死亡的途径,我们分别使用了Caspase的抑制剂、RIP1和RIP3的抑制剂、自噬的抑制剂,结果均未表现出对LCL521诱导的细胞死亡产生逆转作用。即LCL521诱导J774、RAW细胞死亡的途径不是凋亡,不是程序性细胞死亡,也不是细胞自噬。5.神经酰胺类似物LCL521对J774、RAW细胞的作用靶点位于线粒体和溶酶体。经过LCL521处理的J774、RAW细胞采用超高速密度梯度离心和线粒体分离方法,我们分别成功分离到了溶酶体和线粒体,将两种细胞器的溶解产物分别经过LC-MS/MS检测分析,发现大量LCL521定位于溶酶体和线粒体。同时,我们还发现鞘氨醇在溶酶体和线粒体上的含量均明显降低。6.神经酰胺类似物LCL521造成线粒体上Ca2+的过载,引起细胞内ROS的升高,最终导致J774和RAW细胞死亡。经过LCL521处理的J774、RAW细胞采用Ca2+的指示剂Rhod-2-AM和Fluo-3-AM, ROS的指示剂DCFDA检测,发现线粒体和细胞液的Ca2+浓度都明显升高,细胞内的ROS浓度也有明显的升高。为了进一步探究Ca2+的来源及其是否与ROS的变化有直接关系,我们分别使用了细胞内质网Ca2+通道抑制剂和细胞外Ca2+的螯合剂,发现J774细胞的Ca2+来源于细胞外,而RAW细胞的Ca2+来源于细胞内。Ca2+被阻断后,使得细胞内ROS降低,最终引起细胞死亡的减少。7.神经酰胺类似物LCL521激活溶酶体上组织蛋白酶B和D的信号通路,引起J774和RAW细胞死亡。采用组织蛋白酶B和D的抑制剂CA-074me和PA分别单独和联合使用处理的J774和RAW细胞后,加入LCL521作用。我们发现单独使用其中任何一种抑制剂后并没有逆转LCL521引起的J774和RAW细胞死亡,而这两个抑制剂联合使用时,逆转了LCL521诱导的J774和RAW细胞死亡。这表明了神经酰胺类似物LCL521诱导的J774和RAW细胞死亡基于组织蛋白酶B和D信号通路。综上所述,我们发现神经酰胺类似物LCL521能有效诱导肿瘤相关的免疫抑制细胞的死亡,并阐明了神经酰胺类似物LCL521在肿瘤相关的免疫抑制细胞作用中的分子机制。首次揭示了LCL521可以作为一种肿瘤相关的免疫抑制细胞的抑制剂,揭示了神经酰胺类似物作为肿瘤相关的免疫抑制细胞抑制剂的潜能,并为肿瘤诱导的免疫抑制的免疫治疗提供了一条新的思路。