溶藻弧菌和费氏弧菌群体感应相关蛋白的鉴定及功能研究

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群体感应系统是一种广泛存在于不同种属细菌中并对细菌各种生理机制起重要调控作用的菌群交流、通讯和信号转导现象。本论文分别对海洋弧菌群体感应系统调控的与毒力和定殖相关的机制进行了研究,溶藻弧菌的工作在华东理工大学完成,费氏弧菌的工作在美国威斯康辛大学麦迪逊分校完成。   溶藻弧菌是海洋动物弧菌病的重要致病菌之一,但是迄今对它的毒力因子和致病机理认识尚不充分。本课题组前期发现它的一些胞外产物(ECPs)受到群体感应系统的调控。与溶藻弧菌野生株相比,群体感应中枢调控元件LuxO的缺失使胞外蛋白酶和溶血活性物质的产量增加,但使铁载体的分泌减少。本论文分别采用基因芯片和可裂解的同位素亲和标签(cICATs)的方法进一步研究溶藻弧菌的野生株和△luxO突变株的转录表达谱和胞外蛋白表达量的差异,以求鉴定该菌中受群体感应调控的毒力因子。   通过基因芯片的方法,我们鉴定了一个可能的毒力因子MviN。荧光定量PCR的结果表明,mviN的转录表达在△luxO突变株中是上调的,在luxO-con回补菌株中是下调的。蛋白免疫印迹的结果也显示,MviN在对数晚期和稳定期被大量诱导表达,表明MviN的表达是细胞密度依赖性的,并且受到溶藻弧菌群体感应系统调控。mviN插入失活突变株的生长速率比野生株慢很多,表明MviN为溶藻弧菌生长所必需。蛋白免疫印迹的结果还证实MviN是胞外蛋白。当用mviN插入失活突变株的胞外产物处理鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)时,没有发现有细胞毒性。但是用野生株的胞外产物处理EPC细胞时,细胞发生病变,程度随着胞外产物浓度和处理时间的增加而增加。上述结果表明MviN是LuxO调控的胞外产物的组分之一,并且和溶藻弧菌的致病性密切相关。   cICATs结果显示,一个假定的肽酶Pep的胞外表达量在溶藻弧菌野生株和△luxO突变株中有差异。荧光定量PCR的方法证明,LuxO在转录水平下调pep的表达。蛋白免疫印迹结果显示,Pep的表达是细胞密度依赖性的,并且受到群体感应系统调控。△pep无标记突变缺失株游动和群游的运动性减弱,表明它参与溶藻弧菌运动性的调控。在液体培养基中,△pep突变株的极生鞭毛是完整的,而趋化现象相关的基因cheY的表达却是下调的。CheY是一个响应蛋白,会造成鞭毛旋转方向的改变。当△pep突变株生长在硬平板上时,侧生鞭毛消失并且鞭毛合成相关基因flaK、fliS、lafK和lafA的转录水平下调。这些结果表明,Pep是一个LuxO调控的胞外蛋白,并且和溶藻弧菌运动性相关。   费氏弧菌和夏威夷短尾鱿鱼(Euprymna scolopes)是共生关系,可以利用群体感应系统来调控生物发光、宿主定殖和其它生物过程相关基因的表达。前期的实验结果显示,AinS/R群体感应系统调控rpoQ(VF_A1015)的表达。在本实验中,我们应用生物信息学方法证明RpoQ和稳定期sigma因子RpoS有关但是并不相同。过表达rpoQ提高了几丁质酶的表达水平,但是降低了运动性和生物发光能力。上述三种活性和宿主共生和定殖相关。过表达rpoQ使细菌的生物发光水平在体外(液体培养基)和体内(鱿鱼宿主的发光器官中)都降低了,其原因是rpoQ抑制了luxICDABEG启动子的转录。这些结果证明,RpoQ作为一个新的调控元件,在费氏弧菌的群体感应系统中调控一些重要生物过程。
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