自噬(Autophagy)源于古代希腊语，其语源是“phagy”(吃)与“auto”(自我)，顾名思义就是细胞的自我消化，是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的生物学过程。在提供能量、清除异常的细胞器、阻止染色体异常和维持基因组稳定性中起着重要作用。自噬还被认为是Ⅱ型程序性细胞死亡，成为抗肿瘤药物直接或间接诱导细胞死亡的机制，成为抗肿瘤靶向治疗提供潜在靶点。活性氧(reactive oxygen species ROS)是一类含氧的小分子活性物质，包括离子状态的超氧阴离子(O2·-)、羟根离子(OH-)及非离子状态的过氧化氢(H2O2)等。细胞内的ROS大部分由线粒体产生，电子从线粒体呼吸链漏出并和氧气反应生成超氧阴离子O2·-，随后在细胞中转变为其他形式的ROS；除此之外，NADPH氧化酶(NOX)、过氧化物酶体、脂加氧酶、和细胞色素P450氧化酶也参与细胞内ROS的产生。ROS通过对信号转导通路中的关键蛋白、转录因子及激酶结构的修饰，广泛参与细胞的生长和分化等重要的生物学活动的调节。ROS作为一把“双刃剑”也在肿瘤的发生发展及防治过程中起着重要作用：一方面，轻度升高的ROS及氧化应激可以维持肿瘤细胞恶性表型及促进肿瘤的进展；另一方面，多种抗肿瘤的化学药物，如环蒽类抗生素、烷化剂、三氧化二砷、紫杉醇和喜树碱等，都能诱导肿瘤细胞产生大量的ROS，细胞内过量的ROS堆积在化学药物诱导肿瘤细胞死亡中起着一定的作用。三氧化二砷是传统中药砒霜中的主要成分。目前三氧化二砷已经成为急性早幼粒细胞白血病标准治疗药物，在其他实体瘤中也表现出良好的疗效。三氧化二砷的生物学活性非常广泛。目前认为三氧化二砷主要通过抑制线粒体功能、产生ROS引起氧化应激及激活多条信号通路来发挥其抗肿瘤的作用。近期也有研究发现三氧化二砷可以诱导细胞自噬。本研究第一部分旨在深入探讨ROS在三氧化二砷诱导肿瘤细胞自噬中作用及分子机制，阐明细胞自噬在三氧化二砷抗肿瘤效应中的作用。本研究分为两个部分：　　 第一部分：活性氧介导三氧化二砷诱导肿瘤细胞自噬及在抗肿瘤中的作用。　　 ⑴用MTT法检测三氧化二砷对细胞的生长抑制率，结果表明三氧化二砷在体外能明显抑制CNE2和HeLa细胞的增殖活性，呈现明显的剂量-效应关系。其IC50分别为2.65μM和3.70μM。　　 ⑵Western Blot检测可见三氧化二砷处理的CNE2和HeLa细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达均有增加，LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ增加更强且更加明显；EYFP-LC3的黄绿色荧光在三氧化二砷处理组细胞浆中出现大量点状聚集的黄绿色荧光，表明三氧化二砷能诱导CNE2和HeLa细胞发生自噬。RT-PCR检测表明在三氧化二砷处理的CNE2及HeLa细胞中，BNIP3 mRNA水平没有改变，提示三氧化二砷在CNE2及HeLa细胞中诱导的自噬是非依赖BNIP3的，还有其他机制参与其中。　　 ⑶用流式细胞仪检测CNE2及HeLa细胞内H2O2和O2·-的含量发现三氧化二砷可以明显增加细胞中O2·-的含量，而H2O2则没有明显变化。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以完全抑制三氧化二砷诱导的细胞自噬，提示三氧化二砷通过刺激细胞产生ROS而诱导CNE2和HeLa细胞发生自噬。　　 ⑷Western Blot结果显示随着三氧化二砷处理时间的延长，细胞内P62蛋白逐渐增多。免疫荧光法发现三氧化二砷处理的HeLa细胞内P62蛋白增多并在细胞内聚集。自噬体和溶酶体共定位实验显示：在三氧化二砷处理的HeLa细胞中，EYFP-LC3荧光和LAMP-1未发生共定位，说明三氧化二砷阻断了自噬体与溶酶体的融合，抑制了自噬体的降解。　　 ⑸免疫荧光结果表明三氧化二砷处理后，微管的变化与长春新碱处理组相似，与紫杉醇不同，提示三氧化二砷能抑制微管蛋白的聚合，丧失了正常的细胞骨架结构，提示三氧化二砷能抑制微管蛋白的聚合。流式细胞仪检测AO染色绿色荧光结果发现：与对照组相比，在三氧化二砷作用24小时后CNE2及HeLa细胞中绿色荧光增强。免疫荧光结果发现，对照组中Cathepsin L局限在核周，在三氧化二砷作用24小时后，Cathepsin L则弥散在细胞质中。提示三氧化二砷可以损坏溶酶体膜结构的完整性。　　 ⑹在shATG5稳定转染的CNE2和HeLa细胞中，三氧化二砷诱导的细胞毒性作用明显减弱，说明抑制自噬体的形成可以可以抑制三氧化二砷细胞毒性。　　 第二部分：Hirsutanols A通过增加活性氧选择性诱导多西他赛耐药非小细胞肺癌细胞PC14/TXT凋亡和自噬。　　 ⑴结果显示PC14/TXT细胞较PC14细胞对多西他赛、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷及长春新碱的敏感性降低，耐药指数分别为：4.95、2.35、1.74、1.73和1.50。用MTT法检测Hirsutanols A对细胞的生长抑制率，发现Hirsutanols A对PC14/TXT细胞具有明显的细胞毒作用，其IC50值约为28μM且呈现明显的剂量/时间-效应关系，而HirsutanolsA对PC14细胞则没有明显的细胞毒作用。　　 ⑵使用Annexin V/PI双染色法发现检测细胞凋亡的发生情况。30μmol/LHirsutanols A处理PC14/TXT细胞48时早期凋亡率和晚期凋亡率分别为15.5％和15.3％，药物作用72小时后，早期凋亡率和晚期凋亡率分别为13.5％和32.8％。药物处理72小时Western Blot法检测发现caspase3出现17KD的断裂片段，PARP出现89KD的断裂片段。这说明Hirsutanols A诱导PC14/TXT细胞凋亡的发生与caspase3的激活有关。　　 ⑶流式细胞仪分析显示，PC14/TXT细胞中H2O2和O2-的水平均高于PC14细胞，约3.5倍和1.1倍的增高。30μmol/L Hirsutanols A分别处理PC14和PC14/TXT细胞1小时和4小时后检测细胞内H2O2的含量发现：药物处理1小时，PC14及PC14/TXT细胞中的ROS含量都迅速增加并达到峰值，随着时间的延长PC14细胞内的H2O2含量逐渐降低，当药物处理4小时时，PC14细胞内的H2O2含量已恢复到基础水平；而PC14/TXT细胞中则一直仍然维持较高水平的H2O2含量。　　 ⑷流式细胞仪检测发现1mmol/L NAC预处理能完全逆转Hirsutanols A诱导的ROS的增加。1mmol/L NAC预处理细胞1小时后Hirsutanols A处理72小时，MTT检测细胞的活性，可见NAC可明显恢复Hirsutanols A诱导的生长抑制。同时，NAC明显抑制Hirsutanols A诱导的细胞凋亡的发生。　　 ⑸Western Blot结果发现随着Hirsutanols A药物处理时间的延长，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达均有增加，LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ增加更强且更加明显，RT-PCR检测LC3在转录水平发现Hirsutanols A处理后明显上调LC3 mRNA的水平，共聚焦显微镜检测LC3蛋白在细胞内的定位EYFP-LC3结果显示Hirsutanols A处理组细胞内点状聚集的EYFP-LC3荧光。以上实验说明Hirsutanols A能诱导PC14/TXT细胞发生自噬，且上调LC3蛋白的表达。进一步实验发现抗氧化剂NAC研究ROS在Hirsutanols A诱导PC14/TXT细胞发生自噬的作用。NAC能部分抑制Hirsutanols A诱导的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表达和细胞内点状聚集的EYFP-LC3荧光。说明ROS是Hirsutanols A诱导细胞发生自噬的机制之一。我们用两种特异性的自噬抑制剂3-甲基腺氨酸和空泡型质子泵阻断剂bafilomycinA1分别阻断自噬体膜的形成和晚期自噬降解来了解Hirsutanols A诱导自噬在其介导细胞死亡中的作用。在使用自噬抑制剂阻断时，Hirsutanols A对PC14/TXT细胞的细胞毒作用明显增强。说明Hirsutanols A诱导的细胞自噬能促进肿瘤细胞生存。　　 结论：　　 ①三氧化二砷在体外能明显抑制CNE2和HeLa细胞的增殖活性；三氧化二砷通过刺激细胞产生ROS诱导CNE2和HeLa细胞的自噬启动阶段；三氧化二砷阻断自噬体与溶酶体的融合，抑制了自噬体的降解；三氧化二砷抑制微管蛋白的聚合，及损坏溶酶体膜结构的完整性；抑制自噬体的形成可以减弱三氧化二砷的细胞毒性。　　 ②非小细胞肺癌多西他赛耐药细胞株PC14/TXT与敏感细胞株PC14细胞相比表现出对多种化疗药物的敏感性降低；Hirsutanols A是对PC14/TXT细胞具有明显的细胞毒作用，且呈现明显的剂量/时间-效应关系，其IC50值约为28μM，但Hirsutanols A对PC14细胞则没有明显的细胞毒作用；PC14/TXT细胞较PC14细胞有更高的基础ROS水平，Hirsutanols A通过增加ROS诱导PC14/TXT细胞发生凋亡。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以逆转Hirsutanols A诱导的ROS增加，阻断Hirsutanols A诱导的细胞凋亡；Hirsutanols A通过ROS诱导PC14/TXT细胞发生自噬，阻断自噬的发生可以增加Hirsutanols A的细胞毒性作用。