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目的高血压是充血性心衰、中风、终末期肾病的重要危险因子。据WHO统计,全世界成年人群约有15～37%患有高血压病,而60岁以上的某些人群,高血压发病率可达50%。预计到2025年,全世界高血压发病人数将飚升至15亿6千万人。但令人遗憾的是,只有近三分之一的患者降压治疗达标。主要原因在于高血压病是一种终生性疾病,而目前所有降压药的半衰期相对较短,有效作用时间不超过24小时,故必须每天服药,病人不易坚持。此外药物的非特异性和副作用,也使高血压的治疗难以达到预期目标。因此,寻找一种长期有效的、通过调节体内基因表达而控制高血压的方法即基因治疗一直是医学家们努力的目标和方向。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年发展起来的基因阻断技术,该技术通过双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)的介导,在酶的作用下产生大量的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),特异性降解与之序列同源的mRNA,导致转录后水平的基因沉默。研究表明当siRNA呈短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)时,其基因沉默效应更强。本实验即利用先进的RNA干扰技术,选择与高血压病发生发展密切相关的肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)中的血管紧张素转换酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)为靶点,构建ACE-shRNA的表达载体,分别在体外和体内实验中运用该技术抑制ACE mRNA的表达,从而探索其在高血压治疗中的应用前景。方法1.构建靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表达载体:首先在GenBank上选取大鼠ACE mRNA序列,根据siRNA设计原则,设计两条靶序列,并进行BLAST验证。然后合成靶序列单链并退火形成双链,与线性化pGenesil-1质粒载体连接,进行酶切和测序鉴定。构建的两个重组质粒分别命名为pACE-shRNA1与pACE-shRNA2。2.质粒pACE-shRNA转染大鼠血管内皮细胞条件的优化:①植块法原代培养大鼠血管内皮细胞:将Wistar大鼠(体重120～150g)颈椎脱臼处死,无菌状态下取出其胸、腹主动脉,剪切成约1mmx1mm大小的血管片,内膜面壁贴于培养瓶内,在含有胎牛血清的DMEM培养液中进行大鼠动脉血管内皮细胞的原代和传代培养。倒置相差显微镜下观察内皮细胞的形态和生长特性,并进行血管内皮细胞中Ⅷ因子相关抗原(yon Willebrandfactor,vWF)的检测鉴定。②用不同比例的质粒pACE-shRNA与脂质体转染剂METAFECTENE的复合物转染大鼠血管内皮细胞。因质粒中含有绿色荧光蛋白的报告基因,故转染后48小时可在荧光显微镜下观察荧光表达并计算转染效率,同时用MTT法检测细胞存活率,寻求转染效率较高且细胞毒性较低的pACE-shRNA与METAFECTENE的最佳配比。3.质粒pACE-shRNA抑制大鼠血管内皮细胞ACE表达的研究:用pACE-shRNA与METAFECTENE的最佳配比复合物转染大鼠血管内皮细胞,分别于转染前及转染后的24h、48h、72h收集细胞,用RT-PCR及Western blot法检测ACE mRNA及相应功能蛋白的表达。大鼠血管内皮细胞分为四组:①空白对照组(细胞内不加任何干扰因素);②质粒对照组(细胞转染对照质粒);③pACE-shRNA1组(细胞转染pACE-shRNA1);④pACE-shRNA2组(细胞转染pACE-shRNA2)。4.构建靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA重组腺病毒载体:利用AdMax腺病毒包装系统,自先期构建的pACE-shRNA真核表达载体中酶切出ACE-shRNA片段,克隆入穿梭质粒pDC316中,然后将穿梭质粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的腺病毒载体Ad5-EGFP-ACE-shRNA并扩增、纯化、鉴定。5.腺病毒介导的ACE-shRNA对自发性高血压大鼠的治疗作用:自发性高血压大鼠随机分为三组:①空白对照组(尾静脉注射生理盐水);②病毒对照组(尾静脉注射对照腺病毒Ad5-EGFP);③治疗组(尾静脉注射Ad5-EGFP-ACE-shRNA);同时设正常血压对照组(尾静脉注射生理盐水)。以上各组大鼠均注射两次,注射时间均为实验的第1天和第16天。实验期间做以下检测:①注射前后检测血压、心率的变化。②首次注射后第3天,取治疗组大鼠心肌、主动脉、肾脏组织,做冰冻切片,荧光显微镜下观察腺病毒载体吸收情况。③首次注射后第3天,心脏体外采血用ELISA法检测各组大鼠血清中ACE的含量,并且用RT-PCR及Western blot法检测心肌、主动脉、肾脏组织中ACE mRNA及相应功能蛋白的差异表达。④实验结束时,取各组大鼠心肌,做光镜及电镜切片,并检测大鼠全心/体重、左心室/体重,及心肌羟脯氨酸、胶原蛋白的含量,以观察心肌重构的变化。同时采血检测肝肾功能。结果1.经DNA测序和酶切鉴定,证明我们构建的靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表达载体—重组质粒pACE-shRNA1与pACE-shRNA2无基因突变,符合实验要求。2.①植块培养3天左右倒置相差显微镜观察即可发现有内皮细胞从组织块周围移出,大约10天左右细胞开始融合成片,呈“铺路石样”。传代培养的细胞和原代形态相似,生长较快,4～5天可以融合成单层,大概传3～4代左右时,细胞开始变性变形、脱落,不再继续生长。用免疫荧光法鉴定可见胞浆内有大量绿色荧光表达。②根据转染效率以及细胞生存率测定结果,筛选出质粒与转染试剂复合物的最佳配比为pACE-shRNA 1.0μg、METAFECTENE 4μl,此时转染效率为81.2%,细胞生存率为90.2%,优于其他条件时的转染效率并能保证较低的细胞毒性,故作为我们进一步实验的最佳选择。3.pACE-shRNA1组与pACE-shRNA2组在转染后48小时细胞内ACE mRNA及相应蛋白表达均明显降低,与空白对照组和质粒对照组相比均有统计学差异(P＜0.05),72小时表达更低(P＜0.01)。两组相比,pACE-shRNA2组的抑制作用更强一些。而空白对照组与质粒对照组转染前后各时间点ACE mRNA及相应蛋白的表达无明显变化。4.经限制性内切酶、PCR检测和荧光显微镜观察,证实成功构建了能够表达ACE-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒。5.①干预前SHR各组之间尾动脉压差异无统计学意义(P＞0.05),而SHR各组均与正常血压对照组有显著性差异(P＜0.01)。SHR治疗组于首次注射后第3天,尾动脉压下降19mmHg±5mmHg,与治疗前比较有统计学差异(P＜0.05),降压作用可持续14天左右,最大降压幅度达22mmHg,注射后第16天时血压开始回升;第2次注射后,尾动脉压再次明显下降20mmHg±6mmHg,降压作用可持续15天左右,最大降压幅度达21mmHg。而SHR空白对照组和病毒对照组尾动脉压持续升高,正常血压对照组尾动脉压无明显变化。②荧光显微镜下可见心肌、主动脉、肾脏组织的冰冻切片有大量绿色荧光表达,说明Ad5-EGFP-ACE-shRNA可被富含ACE的组织大量吸收。③SHR治疗组大鼠血清ACE含量(16.37ng/ml±3.90g/ml)明显低于空白对照组(48.26ng/ml±1.50ng/ml)与病毒对照组(46.67ng/ml±2.82ng/ml),心肌、主动脉、肾脏组织中ACE mRNA及相应蛋白表达较空白对照和病毒对照组也明显降低(P＜0.05),而与正常血压对照组无统计学差异(P＞0.05)。④光镜切片显示治疗组心肌细胞肥大明显减轻,电镜切片显示治疗组心肌细胞超微结构明显改善。左心室/体重之比与心肌胶原蛋白含量:治疗组(2.24±0.19,1.283μg/mg±0.019μg/mg)显著低于空白对照组(3.21±0.13,1.686μg/mg±0.013μtg/mg)与病毒对照组(3.13±0.12,1.682μg/mg±0.009μg/mg),但还未降到正常血压对照组水平(2.06±0.11,1.257μg/mg±0.019μg/mg)。⑤整个实验期间,各组大鼠心率及肝肾功能均无明显变化。结论:1.成功构建了以大鼠ACE基因为靶位的真核表达载体pACE-shRNA。2.通过血管植块的方法可以实现大鼠动脉血管内皮细胞的原代培养并传代,细胞纯度在90%以上。经过优化转染条件,脂质体转染剂METAFECTENE可以将重组质粒pACE-shRNA高效转染入大鼠血管内皮细胞,并保证较低的细胞毒性。3.真核表达载体pACE-shRNA转染进大鼠血管内皮细胞后可以有效地实现对靶基因mRNA的降解,进而抑制相应功能蛋白的表达。4.成功构建了能够表达ACE-shRNA的重组腺病毒载体。5.腺病毒介导的ACE-shRNA注射入自发性高血压大鼠体内后,成功发挥了基因沉默作用,有效抑制了ACE mRNA及相应功能蛋白的表达,起到了明显、持久的降压作用,并且显著改善了心肌重构,同时未发现明显的副作用。因此,运用RNA干扰技术进行降压治疗是一种非常具用潜力的新策略。