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病毒共感染是自然界中的普遍现象,往往引起更加复杂的临床变化。马立克氏病(MD)和禽网状内皮组织増生病(RE)是两种常见家禽免疫抑制性肿瘤病,分别由马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮组织増生病病毒(REV)引起。MDV是一种禽疱疹病毒,REV是一种逆转录病毒,在临床上两种病毒共感染的情况普遍发生,协同增强致病性和肿瘤形成。据报道,REV可降低MDV疫苗的保护效力,REV的LTR片段能够整合进MDV基因组中促进MDV的水平传播。然而MDV与REV之间的协同作用是否通过二者的协同复制实现的?且其协同复制机制是什么?尚未阐明。共感染状态下,病毒相互之间的协同是病毒共存的相处模式之一。为验证MDV与REV之间的协同复制作用,建立MDV与REV体外共感染模型。免疫荧光显示两种病毒能够定位同一个CEF细胞。病毒生长曲线检测显示MDV与REV共感染状态下两种病毒均复制加快,其转录水平和蛋白表达水平显著升高,并且在共感染48 h达到峰值。为了进一步验证MDV与REV在体内的协同复制作用,建立两种病毒的共感染动物模型。结果显示,共感染组鸡群死亡率和肿瘤发生率均高于单感染组高,并且引起严重生长抑制和明显的组织病变。共感染鸡血液和组织内病鸡组病毒载量也显著高于单独感染组。说明MDV与REV在体内外均存在协同复制作用。具有协同作用的病毒通常通过劫持宿主共同的细胞因子和信号通路来实现其协同复制。为揭示MDV与REV共感染状态下协同复制的分子机制,利用TMT-LC/MS质谱鉴定技术对MDV与REV共感染及单感染的CEF细胞进行蛋白组学分析。通过分析比较MDV与REV共感染组(RM),REV单感染组(R),MDV单感染组(M)和阴性对照组(N)的蛋白表达差异,在共感染组中筛选出98个有差异显著表达的蛋白,其中38个蛋白表达上调,60个蛋白表达下调。对RM/R和RM/M中共表达上调或者下调的蛋白进行聚类分析发现,共感染组中发生显著表达变化的蛋白主要集中在营养代谢、细胞黏附和迁移、ECM受体互作、先天免疫感受器和PPAR信号通路等。STRING蛋白互作分析发现Akt和IRF7两个关键调节因子在MDV与REV协同复制过程中发挥潜在的重要作用。PI3K/Akt是经典的病毒复制通路,Akt作为PI3K/Akt信号通路中枢调节因子,在DNA和RNA病毒复制过程中均扮演重要的作用。为验证Akt通路是否介导了 MDV与REV的协同复制,通过对宿主细胞中的Akt进行过表达和抑制,检测MDV与REV的协同复制作用。结果显示,过表达Akt增强了 MDV与REV各自的复制并且促进了两种病毒的协同复制。使用Akt抑制剂对MDV与REV的单独复制和协同复制都有明显的抑制作用,说明Akt的激活不仅对MDV与REV的复制至关重要,还促进了两种病毒的协同复制。对Akt的经典上游激活因子PI3K进行抑制发现,PI3K抑制剂虽然能够抑制MDV与REV单感染实验组中Akt的磷酸化和病毒的复制,但不能影响共感染状态下两种病毒的协同复制和Akt的磷酸化。因此推测有其他因子参与MDV与REV共感染状态下Akt磷酸化的激活,并导致MDV与REV的协同复制。通过Co-IP实验和前期的蛋白组学分析,筛选出和Akt具有潜在互作关系,并在共感染组显著表达的蛋白-RIOK3。过表达RIOK3促进了 MDV与REV各自的复制,敲低RIOK3消除MDV与REV的协同复制,进一步发现并验证了 RIOK3能够与Akt互作,并导致Akt的磷酸化。相应的RIOK3的突变体K290A不能互作并磷酸化Akt,对MDV与REV的复制也没有影响。以上结果显示,RIOK3/Akt通路介导了 MDV与REV的协同复制。MDV与REV共感染状态下病毒复制量增加,同时诱导宿主细胞内IRF7、MX1等先天免疫通路相关因子的表达量上调,意味着宿主细胞引发更加强烈先天免疫反应。RIOK3能够促进MDV与REV的协同复制,推测共感染细胞内高表达的RIOK3对MDV与REV共同引发的强烈的先天免疫反应有抑制作用。通过过表达和抑制RIOK3,检测MDV与REV共感染细胞中的IFN-β表达水平。结果显示,过表达RIOK3发现能够抑制MDV与REV感染CEF细胞中IFN-β的表达水平。同时RIOK3对poly(I:C)、ISD诱导的IFN-β有抑制作用。在MDV与REV共感细胞中下调RIOK3表达,IFN-β水平升高,病毒复制滴度降低,表明RIOK3在MDV与REV单感染和共感染过程中通过抑制DNA、RNA受体通路,阻碍IFN-β的生成,促进了病毒复制。进一步发现,RIOK3靶向抑制了转录因子IRF7的激活,而对NF-κB的激活没有影响。因此,RIOK3通过与IRF7互作,过磷酸化IRF7,抑制其二聚化,阻碍IRF7进入细胞核,从而抑制IFN-β产生,促进了 MDV与REV的协同复制。这期间RIOK3的酶活性具有重要作用,其突变体K290A同样失去对IRF7和IFN-β的抑制作用。本研究揭示了 MDV与REV协同复制的分子机制,RIOK3-Akt信号通路和RIOK3-IRF7的先天免疫抑制通路介导了 MDV与REV的协同复制。本研究为MDV与REV的共感染及疱疹病毒和逆转录病毒共感染机制研究提供了思路。