一、研究背景缺血性疾病(冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性脑血管疾病、外周血管缺血性疾病)已经成为严重影响人类健康的重大疾病。因此,对于缺血性疾病,探索新的治疗方法和途径就显得有一定的必要性。近年来,治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)为治疗缺血性疾病的治疗提供了一个新的方向。在治疗性血管新生中,选择作用于血管新生不同阶段的几种因子联合应用或先后序贯性治疗,或者选择触发血管新生的“主开关”的因子,可能取得更为明显的疗效。缺氧诱导因子HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)为上游细胞对低氧或缺氧,作出适应性反应的关键性转录因子,已证实能诱导多达100多种转录因子,立体地调整血管生成,为血运重建治疗开辟新的思路。因此,HIF-1α是个十分有应用前景的治疗因子,在医学研究领域,得到了更多的重视。目前已经明确了HIF-1的结构和调控位点,它是由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成异二聚体。其中,HIF-1α是HIF-1能否发挥生物学活性的关键调节单位,其蛋白稳定性和转录活性受氧浓度的高度调节；HIF-1β为组成性成分。在低氧条件下,HIF-1α表达水平增加,与HIF-1β形成异二聚体,从而具有生物学功能。HIF-1α稳定性和活性受氧浓度的调节,是由于HIF-1α含有氧依赖降解区(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD)和转录激活区(Transactivation Domains)。常氧情况下,ODDD区Pro402和／或Pro564被脯氨酸羟化酶(prolylhydroxylase, PH)羟化后,被VHL肿瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumor suppressor)复合物识别,通过泛素蛋白酶途径降解。同时,HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1α,FIH)与HIF-1α C末端转录激活区(C-TAD)结合,通过803位点天冬酰胺残基(Asn803)的羟化,阻止C-TAD与辅助激活因子(CBP/p300)结合,从而抑制其转录活性。在前期的研究中,本课题组已将HIF-1α的564、402、803三个位点联合定点突变,成功构建了三突变型HIF-1α-Triple表达载体(pcDNA-(3.1+)-HIF-1α-Triple),使其在常氧下能够稳定高效表达,为单因素研究HIF-1α基因的功能奠定了实验基础。p53RFP是新近发现的调控细胞增殖和凋亡的一个重要基因,受p53基因的调控,其产物具有E3泛素连接酶活性,通过泛素化降解凋亡重要启动信号p21WAF1参与细胞增殖和凋亡,从而参与细胞周期的调控。目前对这个基因的研究较少。本课题组在前期研究中发现HIF-1α表达增加时,p53RFP基因表达上调。而作为具有E3泛素连接酶活性的p53RFP,是否能够和HIF-1α特异性识别,启动HEF-1α的泛素化降解途径,以及可能存在的机制,并未有相关报道。二、研究目的本研究拟通过验证p53RFP与HIF-1α的降解是否存在关系；进而探索其中可能存在的机制和通路,为进一步研究可能对此过程进行干预,使得HIF-1α在机体缺血低氧的环境中,发挥良性作用奠定理论基础。三、研究方法1、SW480细胞置于低氧培养箱(1%O2,94% N2,5% CO2),在低氧培养的不同时间点,检测HIF-1α和p53RFP蛋白表达水平,明确两种蛋白在延迟低氧的条件下,是否都存在降解过程,推断两者可能存在的关系。2、加入蛋白酶抑制剂MG132,明确HIF-1α在延迟低氧环境下,是否通过泛素蛋白酶体途径进行降解。3、通过干扰试验,阻断和促进细胞内p53RFP的表达,进一步证实HIF-1α在延迟低氧条件下的降解,是否和p53RFP相关。4、通过RT-PCR的方法,证实 p53RFP对HIF-1α转录水平是否存在影响。5、通过在常氧条件下,应用三突变型HIF-1α真核表达载体,证明p53RFP对HIF-1α的降解调节功能,是否依赖于VHL。6、通过在低氧条件下,应用p53抑制剂,探究p53RFP对HIF-1α的降解调节功能,是否依赖于p53。7、通过免疫共沉淀方法,验证p53RFP是否通过泛素化方式和HIF-1α结合,进而发挥其促进HIF-1α降解的作用。8、通过在低氧条件下,应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂,探究p53RFP对HIF-1α的降解调节功能,是否有组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的参与。9、通过在低氧条件下,应用HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA,进一步探究组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2参与p53RFP对HIF-1α的降解,是否与HIF-1α的乙酰化程度相关。四、结果第一部分：HIF-1α的蛋白水平在低氧诱导后开始增加,在观察的几个时间点内,6小时左右HIF-1α在细胞内的达到最高峰,随后的12,18,24小时内HIF-1α发生降解,并最终维持在较低的表达水平。在检测内源性p53RFP蛋白表达时,发现随着低氧培养时间的延长,p53RFP的表达也有一定幅度的增加。在加入蛋白酶抑制剂MG132后,HIF-1α的表达明显上升,不同浓度的蛋白酶抑制剂MG132的阻断HIF-1α降解效果,随着浓度的增加,更加明显。第二部分：与SW480细胞单独低氧处理24小时组相比,瞬时转染外源p53RFP质粒(1,2和6μg)的细胞其胞内HIF-1α蛋白的降解更为明显,且p53RFP的表达量越高,促进HIF-1α蛋白的降解作用越明显。瞬时转染外源p53RFP SiRNA (976) 1,2,6ug的细胞其胞内HIF-1α蛋白的降解更不明显,且p53RFP的表达量越低,减少HIF-1α蛋白的降解作用越明显。常氧和延迟低氧条件下,转染p53RFP与否,HIF-1α mRN A含量未发生明显变化。第三部分：p53RFP和pcDNA-3.1 (+)-HIF-1α-triple转染组与pcDNA-3.1(+)-HIF-1α-triple组相比,HIF-1α表达量明显降低,降解增多,同时p53RFP的表达增加。p53RFP转染组与是否加入p53抑制剂相比,p53RFP和HIF-1α的表达量无明显改变,和未加任何干扰因素相比,p53RFP明显升高,HIF-1α明显降低。随着低氧时间的延长,伴随着其蛋白水平的降解,HIF-1α的乙酰化和泛素化修饰水平均逐渐增强。瞬时转染不同浓度的p53RFP质粒1,2,6ug,经低氧培养24小时后,结果提示在低氧状态下p53RFP可以与HIF-1α直接结合,并促进其泛素化修饰和降解。p53RFP转染组与是否加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂相比,HIF-1α的表达量明显下降。p53RFP转染组与是否加入HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA组相比, HIF-1α的乙酰化程度增加,与p53RFP结合增加,HIF-1α的降解也增加。五、结论第一部分：1.在延迟低氧的条件下,HIF-1α的表达,在初期(6小时左右)呈逐渐上升,随后随着缺氧时间的延长,HIF-1α发生了降解,并维持在低水平。在相同条件下,p53RFP的表达呈逐渐增加。2.延迟低氧条件下,HIF-1α的降解是通过泛素-蛋白酶体通路。第二部分：1.延迟低氧条件下,细胞转染p53RFP质粒后,p53RFP表达增加,促进了HIF-1α降解,p53RFP的表达和HIF-1α的降解存在正相关性。2.延迟低氧条件下,沉默p53RFP表达后,p53RFP表达减少,减少了HIF-1α降解,进一步证实p53RFP的表达和HIF-1α的降解存在正相关性。3.常氧和延迟低氧条件下,p53RFP对HIF-1α的转录水平没有影响。第三部分：1.p53RFP能够促进三突变HIF-1α的降解。2.延迟低氧条件下,p53RFP参与的HIF-1α降解是VHL和p53非依赖的。3.延迟低氧条件下,p53RFP可以与HIF-la直接结合,并促进其泛素化修饰和降解。4.延迟低氧条件下,p53RFP参与的HIF-1α降解受到组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的负调控作用。