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猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种急性,高度传染性的肠道病毒疫病,以2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为主要特征。快速诊断、及时监测和接种疫苗是防控猪传染性胃肠炎的主要措施。ELISA是检测TGEV抗体的最常用方法,也是国际动物卫生组织推荐使用的方法。目前我国使用的TGEV抗体检测ELISA商品试剂盒均为价格昂贵的国外产品,我国自主研制TGEV抗体检测ELISA试剂盒迫在眉睫。当今用于该病防控的疫苗主要是全病毒弱毒疫苗和灭活疫苗,但弱毒疫苗存在毒力返强的安全隐患,灭活疫苗免疫效果不尽如人意,研究安全有效的基因工程疫苗十分必要。本研究立足于猪传染性胃肠炎的防控关键技术,构建TGEV N基因表达载体并在大肠杆菌表达系统中表达,采用表达的可溶性N蛋白作为包被抗原,研究建立了 ELISA抗体检测技术。出于对新型可饲性基因工程疫苗的探索,本研究利用乳酸菌作为载体,进行了 S1基因重组乳酸菌载体的构建,研究成果为进一步进行新型疫苗研究建立基础。1.TGEV N基因的克隆及原核表达根据GenBank中猪传染性胃肠炎毒株N蛋白基因序列,设计合成特异性引物,经RT-PCR获得大小为1179bp的N蛋白基因。将N蛋白基因亚克隆到原核表达载体pColdⅡ中构建了重组表达质粒pColdⅡ-N,经IPTG诱导后在大肠杆菌表达系统中高效表达了可溶性N蛋白,经镍琼脂糖凝胶树脂亲和层析柱和苯基疏水柱层析纯化,SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,重组N蛋白大小约为45ku,与预期结果相符,与TGEV抗血清有良好的免疫反应活性,可作为检测用抗原建立抗体检测技术。2.TGEV iELISA检测技术的建立利用纯化的重组表达的可溶性N蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测TGEV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,间接ELISA最佳抗原包被量为每孔101.5ng,4℃包被过夜;最佳封闭条件为使用含1%BSA的PBS封闭1h;最佳待检血清反应条件为按1:100倍稀释作用1小时;最佳酶标二抗作用条件为按1:10000倍稀释37℃反应1h。按最佳反应条件,对56份阴性血清的检测结果表明,其阴阳性临界值为0.445。试验表明建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、重复性,与PoRV、PEDV阳性血清无交叉反应,与西班牙INGENASA公司生产的猪传染性胃肠炎抗体检测试剂盒检测结果符合率达94.1%。3.分泌表达猪传染性胃肠炎S1基因重组乳酸菌载体的构建本研究同时对包含A、D两个抗原位点的一段TGEV S基因序列(S1)按照乳酸菌密码子偏爱性进行了优化,并且在优化后的S1基因前面加入了乳酸乳球菌信号肽Usp45和带有负电荷的9个氨基酸残基组成的短肽LEISSTCDA,人工合成优化后的片段,克隆入乳酸菌表达载体系统中,构建了重组乳酸菌表达载体,转化入宿主菌NZ9000中,Western-blotting结果显示,经Nisin诱导后,S1蛋白在乳酸菌中得到了有效表达,且表达产物分泌于胞外。