研究目的:　　本实验旨在初步研究丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞的抑制作用及对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响，并分析其可能作用机制。藉此为指导临床使用丹参酮Ⅰ治疗人乳腺癌提供理论依据。　　研究方法:　　1.体外实验　　选择不同浓度（2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μg/ml）丹参酮Ⅰ，分别与人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞孵育一段时间后，(1)利用Cell Counting Kit-8法检测丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞的增殖和细胞毒性;(2)采用平板克隆形成试验观察丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞克隆形成率的影响;(3) DAPI染色观察丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞形态的影响;(4)采用流式细胞仪测定不同浓度丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞凋亡率的影响;(5)采用流式细胞仪测定不同浓度丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞周期的影响;(6) Western blot法检测丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞周期相关蛋白表达的影响;(7) Westemblot法检测丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响以及PI3K抑制剂LY294002干预对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响。　　2.体内实验　　(1)裸鼠皮下成瘤实验:将人乳腺癌MCF-7细胞(1×106/0.1ml)分别接种至裸鼠的背部，2-3周后，观察所成肿瘤大小及侵袭的范围。　　(2)裸鼠成瘤后的药物处理:当肿瘤长到90mm3时开始治疗，将动物按肿瘤大小和体重随机分成3组（6只/组），即对照组[注射99％乙醇和1％Tween-20（0.1mg/10g体重）];低剂量TanⅠ组(5mg/kg);高剂量TanⅠ组(15mg/kg)。每周腹腔注射4次，连续3周，期间动态监测和观察裸鼠的生理状况、卡尺法测量裸鼠人乳腺癌皮下肿瘤的体积变化、计算人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率;当对照组平均瘤体体积达到3750.5mm3时，终止实验进程，处死裸鼠、观察瘤体周围组织的浸润和称量裸鼠瘤体的重量。　　研究结果:　　1.体外实验　　1.1丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞生长抑制作用和克隆率的影响　　1.1.1 Cell Counting Kit-8法检测结果显示，丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞系具有更明显的抑制增殖作用，其抑制作用与药物浓度和作用时间具有依赖性特点。丹参酮Ⅰ对雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞和雌激素受体阴性人乳腺癌MDA-MB-453细胞24 h后的IC50均明显低于12h的IC50(p＜0.05)。　　1.1.2不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后，高浓度(5.0μg/ml)丹参酮Ⅰ组集落形成抑制率显著高于低浓度(2.5μg/ml)丹参酮Ⅰ，且两组间有显著性的统计学差异（P＜0.05）。　　1.2.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响　　1.2.1不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后，经特异性的DNA荧光探针(DAPI)标记证实:对照组MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞均表现为完整的核结构、低强度的蓝色荧光，未见典型的凋亡形态特征;高浓度(5.0μg/ml)丹参酮Ⅰ组人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞数目减少，细胞均表现为高强度的蓝色荧光，出现典型的凋亡形态学特征，且效果明显高于低浓度组(2.5μg/ml)。　　1.2.2不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后，Annexin-Ⅴ FITC/PI双染色结果显示，低浓度丹参酮Ⅰ组细胞凋亡率（14.80±3.34％）和高浓度丹参酮Ⅰ组细胞凋亡率（30.13±4.26％）均明显高于空白对照组（6.78±2.34％），与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05），且高浓度丹参酮Ⅰ组细胞凋亡率明显高于低浓度丹参酮Ⅰ（P＜0.05）（图2-12）。　　1.2.3不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后，流式细胞仪检测DNA含量分布图中，雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞G0/G1期细胞数和G2/M期细胞数逐渐下降，S期细胞数逐渐增加，S期细胞比例从39.42±3.53％上升到51.54±5.71％，两组间有显著性差异（P＜0.01），但低剂量丹参酮Ⅰ组与对照组相比，显著无显著性变化;丹参酮Ⅰ作用雌激素受体阴性人乳腺癌MDA-MB-453细胞48 h后，随着S期细胞数逐渐增加，伴随着G0/G1期细胞比例和G2/M期细胞比例逐渐下降，S期细胞比例从40.34±3.81％（对照组）上升到57.46±5.52％(2.5μg/ml丹参酮Ⅰ)和65.56±6.13％（5μg/ml丹参酮Ⅰ）。　　1.2.4不同浓度丹参酮Ⅰ处理人乳腺癌细胞48 h后，计算机图像分析系统显示，随着丹参酮Ⅰ浓度的增加，人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞内细胞周期蛋白E(Cyclin E)和细胞周期蛋白A(cyclin A)蛋白表达量显著增加，而细胞周期蛋白B(Cyclin B)蛋白表达量显著减少，与对照组比较具有统计学意义(P＜0.05);随着丹参酮Ⅰ浓度的增加，人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞内周期素依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase2，Cdk2)蛋白表达量明显减少，而P27 Kip1和P21 Cip1蛋白表达量均逐渐增加，与对照组比较具有统计学意义。　　1.3丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响　　1.3.1丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响　　计算机图像分析系统分析目的蛋白条带的灰度值与β-actin比值表明，不同浓度丹参酮Ⅰ作用人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞48h后，p-Akt蛋白和p-PI3K表达量随着丹参酮Ⅰ浓度的增加而逐渐下降，各处理组p-Akt、p-PI3K和p-mTOR蛋白表达量与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05），但丹参酮Ⅰ对人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中总Akt蛋白、总PI3K和总mTOR蛋白表达量的影响无明显变化，与对照组相比均无统计学差异（P＞0.05）。　　1.3.2丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的影响　　人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中Bad，Cytochrome C，Caspase-9和Caspase-3蛋白表达量随着丹参酮Ⅰ浓度的增加而逐渐升高，各处理组Bad，Cytochrome C，Caspase-9和Caspase-3蛋白表达量与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05），且两组间相应蛋白也具有统计学差异。　　1.3.3 LY294002干预丹参酮Ⅰ对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响　　我们使用PI3K抑制剂LY294002和丹参酮Ⅰ的不同组合分别干预人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞48 h，计算机图像分析系统显示:单独LY294002或低剂量丹参酮Ⅰ降低了MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白表达（图2-23，图2-24），与空白对照相比均有统计学差异(P＜0.05)，但两组间无显著性差异（P＞0.05）（图2-20）。当LY294002或低剂量丹参酮Ⅰ联合使用时48 h，MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞中p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白表达量明显下降，与单药组相比，均有统计学差异（P＜0.05）。　　2.体内实验　　2.1动物状态监测　　各组裸鼠的精神状态、活动、进食饮水情况相对稳定。各组体重下降均不明显，未出现其它明显变化。　　2.2乳腺癌皮下瘤模型的建立　　荷瘤裸鼠自皮下接种人乳腺癌MCF-7细胞1周左右，裸鼠左侧肉眼可见皮下有一绿豆大小的结节，表明成功建立人乳腺癌皮下模型。　　2.3丹参酮Ⅰ对人乳腺癌皮下瘤的影响　　经药物干预2周时低剂量丹参酮Ⅰ(5mg/kg)组肿瘤抑制率为14.82％，高剂量丹参酮Ⅰ(15mg/kg)组肿瘤抑制率为36.70％;药物干预3周时低剂量丹参酮Ⅰ(5mg/kg)组肿瘤抑制率为22.57％，高剂量丹参酮Ⅰ(15mg/kg)组肿瘤抑制率为56.70％，均明高于正常对照组的肿瘤抑制率(2.2％)，具有统计学意义(P＜0.05)。　　在开始治疗12次后，G2组（5mg/kg TanⅠ组）荷瘤鼠原发肿瘤的平均瘤体重量和对照组(G1)相比无明显差异(p=0.159);但G3组（15mg/kg TanⅠ组）荷瘤鼠原发肿瘤的平均瘤体重量和对照组(G1)相比较减轻更明显(p=0.004)。　　研究结论:　　1.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞具有明显抑制增殖作用，呈现出浓度和时间依赖性;　　2.丹参酮Ⅰ具有明显的抑制人乳腺癌细胞的克隆形成率;　　3.人乳腺癌MCF-7(ER+)细胞和MDA-MB-453(ER-)细胞均被丹参酮Ⅰ阻滞于S期;　　4.丹参酮Ⅰ通过抑制人乳腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞凋亡;　　5.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的瘤体具有明显的生长抑制作用，具有浓度和剂量依赖性。　　6.丹参酮Ⅰ对人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠无明显毒副作用。