论文部分内容阅读
花生是世界上分布最广、种植面积最大的油料作物,种植总面积和总产量均为各种作物之首。土壤盐渍化严重影响了农作物的产量和农业生产的发展,对植物尤其是农作物进行耐盐、耐旱的改良势在必行。传统的遗传育种难以打破种间隔离的限制,而借助于基因工程技术,通过转基因可解决这一问题。已知SOS基因家族及其信号转导途径在植物抗盐及耐盐过程中具有重要作用。本研究从花生(Arachis hypogaea L.)中成功克隆到SOS基因家族成员,包括AhSOS2和AhSOS3全长基因序列,及AhSOSl部分基因片段,并对其表达模式进行分析,在此基础上对部分基因的功能及抗盐能力通过离体测定结合转基因水稻抗盐性分析进行了初步研究。本论文是对花生中SOS基因家族及其生物学功能的首次报道。主要研究结果如下：(1)花生中SOS基因家族成员的分离及表达特性分析本研究以花生“鲁花14”为实验材料,结合RACE的方法,从花生叶片中分离到SOS基因家族成员分别属于SOS1、SOS2和SOS3基因,被命名为AhSOSl、AhSOS2(GenBank登录号：HG797656)和AhSOS3(GenBank登录号：HG977144)基因。其中AhSOS2基因长为1462bp、包含1341bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段,编码446个氨基酸,属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。AhSOS3基因包括651bp的开放阅读框,编码216个氨基酸,属于Ca2+结合蛋白,鉴于花生中AhSOSl基因序列较长,且针对该基因的预测信息存在一定误差,故只获得该基因的部分片段。对SOS基因家族中基因表达模式的荧光定量PCR分析显示,AhSOSl、AhSOS2和AhSOS3基因在花生中均为组成型表达,且经250]mmol L-1NaCl和30%PEG-6000模拟干旱处理后,AhSOS1、AhSOS2和AhSOS3基因在花生的根、茎、叶中表达量均有不同程度的上调。显示SOS基因家族成员表达受盐胁迫及干旱诱导,推测该家族成员在花生抗盐、抗旱及其他抗逆过程中可能具有一定作用。(2)花生AhSOS2和AhSOS3基因原核表达载体的构建及蛋白表达以花生AhSOS2基因和AhSOS3基因CDNA序列为模板,经PCR获得AhSOS2和AhSOS3基因的蛋白编码区,分别将该区段与表达载体pET-28a(+)融合,构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2和pET-28a-AhSOS3,并进一步在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中进行表达。经1.0mmol L-1IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示AhSOS2基因编码一条约51kDa的融合蛋白条带,而AhSOS3基因编码一条约25kDa的融合蛋白条带。且基因的蛋白表达产物在25℃下,随着IPTG诱导时间的延长而表达量逐渐提高,经诱导6h和8h后均可获得较高的蛋白表达水平。以上结果显示,AhSOS2基因和AhSOS3基因可在原核表达系统中进行表达,且随诱导条件的优化,所表达的蛋白量有所提高。该结果为进一步在蛋白水平上研究基因的特性及功能奠定了基础。(3)花生AhSOS2和AhSOS3基因功能的体外及体内验证离体条件下,通过对AhSOS2基因在不同盐浓度平板上的生长实验及菌液培养中原核菌株中的生长曲线测定,结果显示,在250mmolL-1高盐胁迫下,含有重组质粒的大肠杆菌比含有空载体的菌株生长速度快,经培养12h后,AhSOS2基因菌液生长状态及菌液浓度均好于仅含有空载体的菌株的菌液,而含有AhSOS3基因的菌株的生长及菌液浓度也好于仅含有空载体的菌株,且在菌株培养18h后差别最明显,显示转入SOS家族相关基因后,菌株具有了一定的抗盐功能。同时,通过构建AhSOS2和AhSOS3基因的植物双元表达载体并转化水稻,以转基因水稻为材料对基因的生理功能及抗性进行了初步研究。目前,已获得AhSOS2转基因阳性株系20个,AhSOS3转基因阳性株系40个。对AhSOS2转基因株系和对照植株进行NaCl处理后、叶中的Na+、K+含量测定结果显示,随着处理浓度的提高,对照与转基因植株中Na+含量逐渐上升,但转基因水稻中Na+含量相对较低,而K+含量变化恰好相反。盐处理后对植株抗过氧化能力进行测定,随着高盐浓度的提高,对照植株中显示氧化胁迫的红褐色斑点明显多于转基因植株。显示AhSOS2基因在维持植物体内离子稳态以及抗氧化胁迫中可能具有一定的作用。综上显示,AhSOS2转基因水稻在盐胁迫下的生长及表型、含水量及离子含量等方面,均好于对照材料,AhSOS2转基因水稻具有一定的抗盐性,初步证明该基因对提高植物抗盐及耐盐性具有一定作用。