目的:本研究旨在探讨Chromogranin A降解产物Vasostatin-2抗心梗后心衰的作用及其机制。第一部分:探讨Vasostatin-2与心肌梗死后心力衰竭发生以及慢性心衰患者（CHF）不良心血管事件发生率（MACE）的关系。检测并分析心肌梗死后CHF患者血清Vasostatin-2水平,并对这些CHF患者随访3年,继而分析Vasostatin-2水平与心肌梗死后心力衰竭发生和严重度之间的关系;探讨Vasostatin-2水平与这些CHF患者MACE发生的相互关系。第二部分:探讨Vasostatin-2对心肌梗死后心力衰竭发生的干预作用及机制,通过体外和体内实验探讨Vasostatin-2的生物效应及机制。为探讨Vasostatin-2蛋白对缺血性心力衰竭发生的影响,通过结扎冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死后心力衰竭模型,检测心力衰竭大鼠心肌组织中Vasostatin-2的水平,以验证临床数据。克隆并制备重组蛋白Vasostatin-2。将缺血性心力衰竭大鼠随机分为2组,术后48小时后小动物超声心动图检查两组在心脏参数和射血分数方面无差异。之后两组隔日腹腔中注射Vasostatin-2重组蛋白或生理盐水,8周后行超声心动图检查比较两组心功能状况。处死模型,以病理、分子生物学和免疫组化等手段检查大鼠模型心脏大体病理、心肌炎症反应状况、重构和纤维化情况,并探讨相关机制,阐明Vasostatin-2对缺血性心力衰竭的干预效应及作用机制。方法:1.探讨Vasostatin-2与心肌梗死后心力衰竭发生以及CHF患者MACE发生的关系。按入选条件和排除条件,共入选确诊为心肌梗死后CHF患者共515例,均来自上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科2009年9月至2011年5月期间诊断和治疗的ST段抬高型和非ST段抬高型心肌梗死患者。经过进一步筛查,排除了癌症,艾滋病和3年内失随访等不合适患者,最后共有450例CHF患者列入本研究。对照组共149例,来源于每年例行的健康体检和冠脉造影检查阴性者。所有心肌梗死后CHF患者均接受心力衰竭和冠心病心肌梗死指南推荐的药物治疗。患者在出院后每3个月至心衰或冠心病专病门诊、专家门诊进行随访或通过电话联络,共随访3年。随访期间,心力衰竭患者和对照组均在空腹进行完整的临床实验室检查和超声心动图检查。购买商业化酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测血清Vasostatin-2的水平、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和血清高敏C反应蛋白（hs CRP）,同时采用电化学发光免疫测定（ECLIA）试剂盒检测血清NT-pro BNP的水平。随访3年,记录MACE,包括再次心肌梗死、靶血管血运重建术、心脏移植,心血管疾病死亡和需要住院的难治性心力衰竭。另外,若发生中风及各种原因所致的死亡事件,也分别予以记录。2.探讨Vasostatin-2是否对心肌梗死后心力衰竭的发生发展有干预作用,并阐明其相关机制。2.1.克隆制备重组蛋白Vasostatin-2的制备:采用RT-PCR以人293T细胞的c DNA为模板,通过逆转录扩增Vasostatin-2的基因,将测序正确的p ET-15b/Vasostatin-2的重组质粒转化入BL21（DE3）感受态菌中培养,经IPTG诱导能稳定的产生大量的His-Vasostatin-2重组蛋白,经初步纯化、透析后,进行高效液相色谱分子筛法纯化重组蛋白,15%的SDS-PAGE胶鉴定Vasostatin-2重组蛋白,负压冻干干燥蛋白并存储于-80℃。2.2.Sprague-Dawley（SD）心肌梗死大鼠模型共60只,体重250—300克,假手术对照组共30只。用isofluorane混合吸入诱导麻醉,并用1.5%isofluorane保持连续麻醉状态。大鼠经口行气管插管,用Harvard小动物呼吸机维持呼吸。开胸结扎左冠状动脉前降支中间部分。那些在48小时内死亡的心肌梗死大鼠被剔除。为了评价Vasostatin-2对缺血性心力衰竭的影响,术后48小时后将心梗后大鼠随机分为两组,每组30只,进行小动物超声心动图检查,之后一组隔天予以腹腔注入重组蛋白Vasostatin-2（100μg）,另一组则予以相同剂量的生理盐水腹腔注射。大鼠常规喂养8周,在8周末再次行超声心动图及血流动力学检测评估两组大鼠的心功能状况。并在8周末处死动物模型及假手术组大鼠,分别留取心肌标本,称量心脏重量,计算心脏重量与体重比值（mg/g）作为心脏重量指数。分离心房、心室,留取左室游离壁非梗区心肌组织和梗死区组织,-80℃保存。组织学样本予以4%福尔马林浸泡。之后以病理、分子生物学和免疫组化等手段检查大鼠模型心脏大体病理、心肌炎症反应状况、重构和纤维化情况。2.3.进行体外实验探讨Vasostatin-2生物效应及机制。培养大鼠H9C2心肌细胞进行缺氧实验,以不同剂量的vasostatin-2刺激细胞,探讨其对细胞的影响、信号通路和相关机制。结果:1.心肌梗死后CHF组患者血清Vasostatin-2水平为（17.85±9.76）ng/ml,明显低于对照组（45.69±56.27）ng/ml（P<0.001）,而TNF-α、hs CRP及NT-pro BNP水平心肌梗死后CHF组均明显高于对照组（P<0.001）。2.平均3年的随访期间,共有272例CHF患者发生MACE,占60.4%。包括再次心肌梗死54例（12%）、脑卒中患者27例（6%）、靶血管血运重建术26例（5.8%）、因心衰再次入院261例（58%）,心血管原因死亡46例（10.2%）。值得注意的是,发生MACE的心肌梗死后CHF患者与未发生MACE的CHF患者相比,血清Vasostatin-2的水平显著降低（12.24±8.31 vs.23.95±7.92 ng/m L,P<0.001）,而NT-pro BNP、hs-CRP和TNF-α的水平则明显升高,均达到非常显著的统计学意义（P<0.001）。并且,血清Vasostatin-2水平与LVEF呈正相关（Spearman’s r=0.377,P<0.05）,与心衰阶段呈负相关（r=-0.288,P<0.05）,与NT-pro BNP水平呈负相关（r=-0.294,P<0.05）。Logistic逐步回归分析结果显示,降低的血清Vasostatin-2的水平和其他传统危险因素（高龄、高血压、糖尿病、肌酐、尿酸、GFR降低、严重的心衰阶段和降低的LVEF值）、生物标志物水平（NT-pro BNP、hs CRP和TNF-α）均与心肌梗死后CHF患者发生MACE的危险独立相关（P<0.05）。3.在注射Vasostatin-2或生理盐水前给两组心肌梗死大鼠行小动物超声心动图检查,显示两组大鼠相比较左室内径等心脏参数和左室射血分数无统计学差异。大鼠心梗造模后随访8周,生理盐水组大鼠共死亡5只,注射Vasostatin-2组大鼠死亡2只,均由于明显的心脏原因。值得注意的是,8周末再次行超声心动图检查并用Millar压力记录导管行血流动力学检查,结果显示注射Vasostatin-2组大鼠相比生理盐水组大鼠,左室舒张末期内径缩小0.54mm、左心室舒张期末压力降低3.4mm Hg,左室射血分数提高6.7%（p<0.05）。并且,注射Vasostatin-2组大鼠相比较生理盐水组大鼠,等容收缩期左心室内压力上升的最大速率+dp/dt和等容舒张期左心室压力下降的最大速率-dp/dt均明显较高,具有统计学显著差异（p<0.01）。以上结果提示Vasostatin-2可以改善心功能。4.Vasostatin-2减少心肌梗死大鼠心肌重构,心肌间质纤维化和炎症反应。组织学研究显示,注射Vasostatin-2组心肌梗死后心力衰竭大鼠与对照组相比较,心肌细胞的横截面积减小,心肌间质纤维化程度显著降低,心梗诱导表达的几个关键细胞外基质蛋白,如胶原蛋白,胶原纤维连接蛋白,基质金属蛋白酶-2（MMP2）和基质金属蛋白酶-9（MMP9）等明显降低。Western Blot蛋白免疫印迹法测定结果显示,注射Vasostatin-2组心肌梗死后心力衰竭大鼠白介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达率明显低于对照组大鼠。此外,心肌组织免疫组织化学染色检查显示,心肌梗死后心力衰竭大鼠相比假手术组大鼠,在肿瘤坏死因子的水平、白介素-6、TLR-4、MMP2和MMP9水平均大大上调,巨噬细胞表面标志物CD68和细胞毒性T淋巴细胞CD8的表达明显增加,但是这些病理变化在Vasostatin-2注射组大鼠中均受到显著抑制（P<0.05）。在探讨Vasostatin-2作用实验中,我们先用Vasostatin-2处理大鼠心肌细胞H9C2和大鼠腹腔巨噬细胞,之后进行m RNA microarray芯片检测和生物信息学分析。发现在这些细胞中,Vasostatin-2显著抑制炎症反应、巨噬细胞激活、细胞骨架激动、促重构和增殖等病理生理过程中的主要基因,下调肾素血管紧张素系统（RAAS）中ACE水平;同时上调拮抗炎症基因和ACE2表达。提示Vasostatin-2对细胞因子、趋化因子、代谢、小G蛋白、Toll样受体、Wnt等通路和RAAS系统有调控作用,这些发现均在假手术对照、PBS和Vasostatin-2注射大鼠心肌组织中得到验证,表明Vasostatin-2通过调节Rho、Wnt和TLR-4通路和RAAS等多种机制对心肌梗死后心力衰竭的发生发展有干预作用。结论:1.心肌梗死后CHF患者血清Vasostatin-2水平明显降低,并且在发生MACE的CHF患者与未发生MACE的相比,血清Vasostatin-2的水平显著降低。提示血清Vasostatin-2水平与心肌梗死后心力衰竭发生以及CHF患者MACE发生具有关联,可作为CHF患者辅助诊断和预后判断的指标之一。2.在缺血性心肌梗死大鼠,Vasostatin-2治疗组比PBS治疗组心功能改善明显,梗死面积、心肌重构和纤维化分别显著减少。Vasostatin-2通过上调ACE2和下调ACE;抑制Rho A和Rac1-PAK1通路、Wnt-β-catenin和TLR-4通路;降低炎性细胞因子水平和抑制炎症反应等多种机制干预心肌梗死后心力衰竭的发生发展。