骨质疏松症是以骨量减少,骨的微观结构破坏,导致骨的脆性增加,容易发生脆性骨折为特征的全身性骨骼疾病。本病的发生与性别及年龄相关,多见于绝经后女性及老年男性。本文主要研究与雌激素缺乏密切相关的绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis, PMO)。由于绝经后妇女的卵巢机能或功能低下,导致雌激素的分泌水平下降,负反馈调节垂体和下丘脑的作用减弱,使得雌二醇、生长素和甲状腺激素下降,促卵泡素和黄体生成素上升,最终导致骨吸收增加。在细胞水平,骨丢失是由于破骨细胞与成骨细胞的功能活动失衡所致。而绝经后骨质疏松症是属于骨吸收及骨形成均活跃,而骨吸收活动大于骨形成的高转换型骨质疏松症。研究发现,核受体ER及ERR-α均参与雌激素调节骨骼代谢的过程。配体与核受体结合后,引起核受体的构象变化,进而激活了核受体,导致基因表达的上调或下调。核受体的转录活性也受到辅激活物的调控,对核受体调控的基因表达有重要作用。辅激活物中的SRC家族通过调节ER活性以影响骨代谢,而PGC-1家族通过与ERR a相互作用来调节骨健康。骨组织作为人体一个庞大而复杂的系统,通过多种细胞在激素、神经及细胞因子等的作用下完成正常生理活动。本文主要进一步探讨辅激活物SRC-3及PGC-la在骨代谢中的作用机制,并初步探讨补肾壮骨方防治绝经后骨质疏松症的机理,为中医药防治疾病提供分子理论支持,同时为绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供更多的选择。目的：探讨辅激活物SRC-3、PGC-1α对MG63细胞成骨分化的作用机制；观察补肾壮骨颗粒对去势大鼠骨密度、骨代谢相关指标及辅激活物SRC-3的影响。方法：1细胞研究通过腺病毒沉默或高表达技术,研究辅激活物SRC-3和PGC-1a在MG63细胞中的成骨分化及增殖等作用。采用MTT检测细胞增殖能力,ALP活性检测细胞的成骨能力,并进一步采用real-time PCR检测MG63细胞表达成骨特异基因ERRa, OPN, Runx2, Osteocalcin, Osterix mRNA的水平,Western blot检测细胞MAPK信号通路中的P38MAKP、JNK及ERKl/2的磷酸化水平等。同时应用MAPK通路阻滞剂,通过ALP活性检测、real-time PCR检测及Western-blotting检测探讨SRC-3、PGC-1a在MG63细胞向成骨分化过程中,对MAPK信号通路中相关蛋白表达的影响。2动物研究通过去势大鼠建立绝经后骨质疏松症模型,同时应用补肾壮骨颗粒进行干预,以阿仑膦酸钠(ALEN)作为阳性对照,采用DXA检测、ELISA及real-time PCR等技术研究补肾壮骨颗粒对大鼠左侧股骨骨密度,外周血PINP-CTX、SRC-3水平,及股骨骨髓中SRC-3 mRNA的表达。结果：1腺病毒携带SRC-3和PGC-1α经P38MAPK通路调控MG63成骨分化1.1人SRC-3和PGC-1α基因沉默和高表达腺病毒构建与鉴定沉默组腺病毒的构建与鉴定：通过real-time PCR和Western blot筛选出沉默效率最高的siSRC-3-3和siPGC-1α-1序列,设计并合成相对应的shRNA序列,提取重组穿梭质粒,再转染293A细胞以扩增病毒,获取Adeno-shSRC-3、Adeno-shPGC-1α及Adeno-shCon(阴性对照)的病毒滴度分别为0.98×109ifu/mL、1.30×109ifu/mL和1.95 ×109 ifu/mL。感染MG63细胞后,用qPCR和Western blot验证目的基因及蛋白的沉默效果,表明腺病毒携带的shSRC-3和shPGC-1a对SRC-3和PGC-1α的沉默效果较好。高表达组腺病毒的构建与鉴定：数据库内查询SRC-3和PGC-1a核苷酸序列,以cDNA为模板,进行大量扩增,添加重组穿梭质粒的多克隆位点,构建重组穿梭质粒构,并转染293A细胞以扩增病毒,获取pAD-SRC-3、pAD-PGC-1a及pAD-Con(阴性对照)的病毒滴度分别为0.18×109 ifu/mL、0.43×109ifu/mL和0.89×109ifumL。感染MG63细胞后,用qPCR和Western blot法检测到SRC-3和PGC-1α的存在,表明腺病毒携带的SRC-3和PGC-1α能够正常表达。1.2沉默或高表达腺病毒转染MG63细胞的增殖与成骨能力检测MG63细胞的增殖能力：沉默组的Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1 a组对MG63的增殖抑制能力最强,其次为Ad-shPGC-la组,最后为Ad-shSRC-3组；高表达组的pAd-SRC-3+p Ad-PGC-1a组对MG63促进增殖的能力最强,且在72h时的细胞增殖能力较沉默组均较高(P<0.05)。ALP活性检测MG63的成骨能力：转染MG63细胞24h及48h后,各沉默组及各高表达组之间的ALP活性无差别(P>0.05)。而在转染72h后,各组之间的ALP活性有统计学意义(P<0.05),且pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a组的ALP活性高于其他组,与Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a组及pAd-Con组比较具有统计学差异(P=0.024,P=-0.023)；其余各组组内两两比较无统计学差异(均为P>0.05)。MG63细胞中成骨相关基因ERRα、OPN、Runx2 mRNA等基因的表达：转染MG63细胞48h后提取细胞总RNA,高表达组的pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a组的ERRa、Runx2、 Osteocalcin及Osterix mRNA表达水平均明显高于其他组(分别为P<0.01,P<0.001, P<0.001, P<0.001),而沉默组的Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1 a组是最低的；各组之间的OPN mRNA表达水平无差别(P>0.05)。MG63细胞中P38MAPK、JNK、ERK1/2等蛋白的磷酸化水平：转染MG63细胞48h后提取细胞总蛋白,高表达组的pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a组P-P38MAPK蛋白的表达水平明显高于沉默组、pAD-Con组及pAD-SRC-3组pAd-Con组(p<0.01)；而各组p38MAPK、JNK、P-JNK、ERKl/2、P-ERK1/2蛋白的表达水平差异不大。1.3MAPK通路阻滞剂干预沉默或高表达腺病毒转染MG63细胞后的细胞成骨能力3个MAPK通路阻滞剂干预后MG63细胞的ALP活性：pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a组的ALP活性比各对照组均高(P<0.001),而与pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a+SP600125组和pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a+PD98059组无差别(P>0.05)；而pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a+SB203580组的ALP活性较pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a组明显下降(P<0.001),说明重组腺病毒介导pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a双基因联合转染MG63细胞干预可促进ALP活性,经阻滞剂SB203580干预后可阻断ALP活性,而经阻滞剂SP600125及PD98059干预后ALP活性变化不大。3个MAPK通路阻滞剂干预后MG63细胞中P38MAPK、JNK、ERK1/2等蛋白的磷酸化水平：阻滞剂干预MG63细胞48h后提取细胞总蛋白,pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a组P-P38MAPK蛋白的表达水平明显高于Control组(P<0.01),而pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a+SB203580组与Control组无差别(P>0.05)；而各组p38MAPK、JNK、P-JNK、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表达水平差别无统计学意义(P>0.05),说明pAd-SRC-3+pAd-PGC-la组可促进P-p38MAPK蛋白的表达,而p38MAPK通路阻滞剂可抑制其表达。p38MAPK阻滞剂SP600125干预后MG63细胞中成骨相关基因ERRa、Runx2、 Osteocalcin、Osterix mRNA等的表达：经P38MAPK阻滞剂SB203580处理MG63细胞48h后提取总RNA,SRC-3、PGC-la共高表达可促进MG63中ERRa、Osteocalcin及Osterix mRNA的表达水平,而P38MAPK通路阻滞剂SB203580可阻断其表达：但SRC-3、PGC-1a共高表达对MG63的Runx2 mRNA表达无显著性影响。2补肾中药复方促去势大鼠骨质疏松骨形成中对SRC-3和PGC-1α表达的影响2.1补肾中药复方可提高去势大鼠骨密度干预12周后骨密度变化：OVX组的大鼠左侧离体股骨骨密度低于Sham组(*P<0.001),说明骨质疏松症大鼠模型造模成功。BSZG组与ALEN组的骨密度均比OVX组高(均为P<0.01)；而BSZG组与ALEN组之间的骨密度差别无统计学意义(P>0.05),说明BSZG组可有效防治OVX模型大鼠的骨质疏松症,且与ALEN组的效果相当。2.2补肾中药复方对去势大鼠血清学指标的影响OVX组的血清PINP、CTX水平高于Sham组(P<0.001),且BSZG组及ALEN组的血清PINP、CTX水平均低于OVX组(P<0.001),而BSZ组与ALEN组之间的血清PINP、CTX水平无统计学差异(P>0.05)。说明BSZG组及ALEN组均可降低去势大鼠血清PINP、CTX水平,且二者作用相当。OVX组的血清SRC-3水平低于Sham组(P<0.001)；但BSZG组的血清SRC-3水平显著性高于OVX组和ALEN组(分别为P<0.001,P<0.05)。说明BSZG组可提高去势大鼠血清SRC-3水平,优于ALEN组。2.3补肾中药复方对去势大鼠SRC-3 mRNA表达的影响OVX组、BSZG组及ALEN组的去势大鼠股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相对表达水平均低于Sham组(P<0.05)；但BSZG组的股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相对表达水平高于OVX组(P<0.05),而ALEN组与OVX组无差别(P>0.05)。说明BSZG组可提高去势大鼠股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相对表达水平,且效果优于ALEN组。结论：在细胞水平阐述了MG63中表达SRC-3和PGC-1α,通过腺病毒介导SRC-3和PGC-1α双基因联合高表达,转染MG63后,促进了MG63增殖,激活了内源性ERRa的基因表达及P38MAPK通路,提高了ALP活性以及成骨特异基因Runx2、Osteocalcin、 Osterix的表达,进而促进MG63成骨分化。而shSRC-3和shPGC-1a双基因联合沉默可抑制成骨分化。补肾中药复方可能是通过提高骨髓组织中SRC-3 mRNA表达水平,从而提高去势大鼠骨密度,降低骨转换水平。