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目的:肿瘤坏死因子(TNF-α)是种植体周围炎中主要的炎性因子,而骨形态发生蛋白2(BMP-2)可以诱导新骨形成,但成骨效率受TNF-α介导的炎症程度影响。微小RNAs(Mi RNAs)是小片段非编码的RNA分子,在TNF-α介导的炎性过程或BMP-2介导的成骨过程中均有参与,其中的机制未见报道。本实验从TNF-ɑ为切入点,研究在BMP-2诱导成骨过程中,TNF-ɑ对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),miRNA和靶基因的调控作用。方法:1.采用流式细胞仪及定向诱导分化方法鉴定分离培养的hBMSCs;碱性磷酸酶染色(ALP staining)及半定量实验验证TNF-α对hBMSCs成骨分化的负调控作用,同时通过AnnexinⅤ联合PI染色法及cck8检测TNF-α是否影响hBMSCs增殖和促进凋亡。2.实时定量PCR(RT-PCR)对实验组前期芯片结果筛选出的miRNAs进行hBMSCs验证,观察TNF-ɑ对BMP-2诱导成骨分化过程中miRNA表达的影响;并利用miRNA靶点预测软件对差异表达最明显的miRNA(miR-33a-5p)进行靶基因预测。3.双荧光素酶报告基因技术验证靶基因预测结果,RT-PCR和蛋白质印迹法(Western Blot)验证miR-33a-5p对靶基因的调控方式;试剂公司化学合成miRNA inhibitor和mimic,转染至hBMSCs,使miR-33a-5p表达沉默或增强,运用茜素红染色,碱性磷酸酶染色及RT-PCR,Western Blot验证相关成骨基因的表达情况。4.RT-PCR和Western Blot观察BMP-2,TNF-α在不同浓度和时间点刺激后,SATB2表达情况。5.试剂公司化学合成miR-33a-5p inhibitor,si-SATB2转染至hBMSCs,茜素红染色,碱性磷酸酶染色及RT-PCR,Western Blot验证相关成骨基因的表达情况;最后,转染SATB2过表达质粒,验证RUNX2信号通路是否受到影响。结果:1.hBMSCs分离培养后,经鉴定高表达间充值干细胞表面标志物,并具有多向分化能力;碱性磷酸酶染色和半定量实验证实TNF-α对hBMSCs成骨分化的负调控作用;AnnexinⅤ联合PI染色法及cck8排除TNF-α对hBMSCs增殖和凋亡的影响。2.在hBMSCS中,TNF-ɑ对BMP-2诱导成骨分化的过程会导致miR-33a-5p表达明显上调,并且这种作用主要来自于TNF-ɑ;经软件预测,SATB2有可能是miR-33a-5p的靶基因。3.双荧光素酶报告实验显示过表达miR-33a-5p后,能明显抑制含野生型SATB2-3’UTR的荧光素酶的活性而对连接有突变的SATB2-3’UTR的荧光素酶活性没有抑制作用,因此,SATB2是miR-33a-5p的直接靶基因;随后,RT-PCR实验排除miR-33a-5p对SATB2 m RNA降解可能性,Western Blot证实miR-33a-5p通过影响SATB2的蛋白转录抑制其表达;体外敲除miR-33a-5p后,hBMSCs成骨分化活性增高,而miR-33a-5p过表达后,成骨分化活性降低。4.BMP-2刺激1,3,7天后或浓度依次为50ng/ml,100ng/ml,150ng/ml和200ng/ml时,SATB2表达逐渐增加;当加入不同浓度TNF-α后,SATB2 m RNA的表达随TNF-α浓度的增加而下降,而在TNF-α浓度为10ng,20ng和30ng时,SATB2蛋白表达却无变化。5.转染miR-33a-5p inhibitor后,成骨相关基因表达明显上升,而转染siSATB2,实现SATB2敲除后,这种作用被明显抑制;最后,Western Blot证实SATB2过表达可引起RUNX2蛋白表达明显增高,且二者变化趋势密切相关。结论:TNF-α通过抑制miR-33a-5p负调控BMP-2诱导的人BMSCs成骨分化过程,其中,miR-33a-5p的直接靶基因SATB2部分通过RUNX2调控成骨。