研究背景和目的随着国内人口年龄结构逐渐步入老龄化,许多老龄化相关的疾病日渐引起医学界的广泛重视。骨质疏松作为一种老年人群高发的疾病,尤其重度骨质疏松具有较高的骨折风险,同时此类骨折发生后容易迁延不愈,是严重影响老年人健康和生活质量的一类骨科门急诊常见病。世界卫生组织已将骨质疏松、糖尿病与心血管病一起列为影响中老年人健康的“三大杀手”。此外,临床上因严重暴力所致的大段骨缺损、骨折后不愈合以及骨不连一直以来都是创伤骨科中的治疗难点。以上疾病的发生和发展均与机体内骨代谢失衡,成骨能力受损密切相关。因此,对成骨机制的研究和探索,将可能为这些临床问题的解决提供支持。人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)作为成骨细胞重要的一种前体细胞,在骨的形成和成骨分化上都起着重要的作用。随着对间充质干细胞成骨机理的研究不断深入,将有助于我们更好地理解多种骨病的病理过程,为此类疾病的治疗寻找新的思路。此外,hBMSCs具有较强的增殖能力和多向分化潜能,是骨组织工程领域最重要的种子细胞来源,同时在干细胞移植领域也具有广泛的应用前景。microRNA(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物细胞内的非编码单链小分子RNA,它能够与靶基因的3’非翻译区部分碱基互补结合,继而调控基因的表达,在生物体内众多基本的生理和病理过程中都扮演着重要的角色。近年来,越来越多的研究表明miRNAs在成骨细胞和破骨细胞的动态平衡中起着重要的调控作用,并且直接参与了诸多骨病如骨质疏松、关节炎等疾病的发生和发展过程。有研究发现,miR-125b在成骨过程中下调,但具体的调控机制尚不完全明了。本研究选定miR-125b作为研究对象,希望通过对miR-125b调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究。进一步丰富干细胞成骨定向分化的理论体系,同时可加深对骨骼发生、发育的分子机制认识,为骨质疏松防治,骨折治疗,骨缺损修复寻找新的治疗思路并提供理论支持。研究方法1.人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定使用密度梯度离心的方法,从健康成年志愿者捐献的骨髓中分离获取hBMSCs,通过传代、培养、纯化,获取稳定的干细胞来源。培养过程中注意观察贴壁细胞形态变化,使用MTT法检测其增殖活力。经流式细胞术检测细胞表面抗原对细胞属性进行鉴定,通过成骨、成脂、成软骨诱导分化,对hBMSCs的多向分化能力即干性进行鉴定。2.miR-125b对hBMSCs成骨分化的影响用慢病毒转染的方式对细胞进行干预。首先将人工合成的miR-125-pre和miR-125b-inhibitor核酸序列构建到慢病毒载体并转染hBMSCs。对转染后的细胞转染效率和增殖能力进行观察检测。然后,采用Real Time RT-PCR技术检测转染后细胞内miR-125b表达量的变化。最后,使用Real Time RT-PCR和Western Blot对间充质干细胞成骨分化过程中重要的成骨因子包括ALP,Runx2,OSX以及OCN的表达情况进行核酸和蛋白水平上的检测,观察其表达变化情况。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,通过细胞显色情况鉴定其成骨分化能力。3.miR-125b调控hBMSCs的作用靶点预测及验证首先,选用生物信息学的方法,使用Target Scan,miRanda及Pic Tar作为靶基因预测工具,对可能与miR-125b结合的靶基因序列进行筛选预测,选择可能与其结合的潜在靶点BMPR1b作为研究对象。随后,构建BMPR1b的荧光素酶报告载体,使用双荧光素酶报告的方法对所预测的靶基因进行初步验证。最后,将hBMSCs分别转染miR-125b的上调和下调慢病毒载体,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测当细胞内miR-125b表达水平变化时,BMPR1b的mRNA和蛋白表达变化。4.miR-125b抑制hBMSCs成骨分化的机制首先使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测hBMSCs成骨过程中BMPR1b的表达变化。随后,采用RNAi技术,将BMPR1b的siRNA载体转染hBMSCs,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测Runx2,OSX以及OCN的mRNA和蛋白表达变化。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,鉴定成骨分化能力。最后,将miR-125b-inhibitor与si-BMPR1b共转染hBMSCs,使用Real Time RT-PCR和Western Blot检测Runx2,OSX以及OCN的mRNA和蛋白表达变化。采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色的方法对转染后的细胞进行染色观察,鉴定成骨分化能力。5.miR-125b调控hBMSCs成骨分化的体内研究首先,建立裸鼠股骨原位骨缺损模型。随后,将miR-125b-inhibitor转染hBMSCs,将细胞复合至DBM后进行成骨诱导,再通过手术的方式将DBM移植至裸鼠体内,利用micro CT观测新骨生成状况,采用组织切片,HE染色和Masson染色,从细胞的微观角度评估成骨能力。研究结果1.本实验所采用的密度梯度离心法分离获取hBMSCs,培养过程中细胞各项指标表明hBMSCs细胞形态正常,具有较强的增殖活力。hBMSCs的阳性表面抗原CD73,CD90,和CD105阳性率均在95%以上,而阴性抗原CD34,CD45,CD14,CD19,HLA-DR阳性率在5%以下。符合hBMSCs鉴定标准。此外,分离培养的hBMSCs具备成骨、成软骨和成脂的多向分化能力,具备良好的干性。2.在hBMSCs向成骨分化的过程中,miR-125b处于低水平表达的状态。慢病毒载体对hBMSCs转染效果较好,且对细胞的增殖不产生影响。在hBMSCs成骨分化过程中,上调miR-125b表达能够抑制成骨。相反地,下调miR-125b则能够促进hBMSCs的成骨分化。3.生物信息学预测出BMPR1b基因可能是miR-125的作用靶点。双荧光素酶报告实验证实miR-125b在细胞内能与BMPR1b的3’UTR部分碱基序列存在结合位点。在hBMSCs中,上调miR-125b能够抑制BMPR1b的mRNA和蛋白表达。相反,下调miR-125b则能够增加BMPR1b的mRNA和蛋白表达量。4.hBMSCs成骨分化过程中,BMPR1b呈高表达状态。沉默BMPR1b的基因后,hBMSCs的成骨能力下降。miR-125b-inhibitor与si-BMPR1b共转染hBMSCs后,hBMSCs的成骨分化能力同样受到抑制。5.对miR-125b调节成骨分化的体内研究发现,转染miR-125b-inhibitor后的hBMSCs,micro CT和组织切片染色其体内成骨能力强于阴性对照组。结论1.本实验所分离培养的hBMSCs增殖活跃,符合间充质干细胞的一般形态学特点。干细胞特性明显,经不同条件诱导,能向成骨、成脂以及成软骨细胞分化。纯度较高,干细胞来源稳定可靠。2.miR-125b能够负向调控hBMSCs成骨分化。3.miR-125b通过与靶基因BMPR1b的3’UTR部分碱基互补结合,从而抑制BMPR1b的表达。4.miR-125b通过抑制其靶基因BMPR1b的表达,进而抑制hBMSCs的成骨分化。5.复合hBMSCs的DBM骨移植材料,能够在体内较好地修复骨缺损。下调miR-125b的表达后,能够进一步提高h BMSC在体内的成骨能力。