金黄色葡萄球菌是临床上最常见的致病菌之一，能引起多种组织器官的严重感染。自1959年耐酶半合成青霉素甲氧西林应用于临床以来，很快就出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，并迅速成为引起医院和社区感染的主要致病菌。研究证实，MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药机制主要是由于葡萄球菌细胞膜表面的青霉素结合蛋白发生变化所致，即MRSA获得了外源性mecA基因，该基因编码产生一个额外的青霉素结合蛋白2a(penicillin-binding protein 2a，PBP2a)，其与β-内酰胺类抗生素亲和力极低。在β-内酰胺类抗生素存在的条件下，宿主正常PBP被抑制，PBP2a可代替这些被抑制的PBP发挥生物催化功能，完成细菌细胞壁的生物合成，使细菌得以生存，故表现为对β-内酰胺类抗生素耐药。由于mecA仅存在于对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，被认为是来源于相近种属的外来遗传物质，经变异进化成MRSA的耐药决定簇。在对β-内酰胺类抗生素敏感和耐药的松鼠葡萄球菌中，普遍存在着一个与mecA高度相似的基因，即松鼠葡萄球pbpD，其编码同样与β-内酰胺类抗生素亲和力极低的松鼠葡萄球菌PBP4，目前已被接受为金黄色葡萄球菌mecA的遗传学前体。虽然在基因水平和蛋白质功能水平，MRSmecA与松鼠葡萄球pbpD高度相似，但不容忽视的是这两个基因的核酸和蛋白序列仍具有明显的差异。深入研究两者间的差异，有助于对MRSA耐药机制的进一步认识和对mecA基因进化过程的全面了解。目的本研究中，我们通过不同的葡萄球菌背景来观察8个各具代表性的mecA／pbpD杂合子的表达，研究金黄色葡萄球菌PBP2a与松鼠葡萄球菌PBP4的功能性差异和相关性。试图探明金黄色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD在导致甲氧西林耐药中的作用，比较两个基因在甲氧西林耐药和支持细菌生长方面的效率。研究PBP2a与PBP4两个功能性域在耐药表型和细菌生长方面的遗传学变化，以揭示金黄色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD在nPB域和TPase域的差异，从而在功能域基础上探究mecA基因的进化结果。方法1使用高保真PCR和分子克隆技术构建mecA基因与pbpD基因杂合子(尤其构建PBP2a与PBP4nPB：TPase杂合子)，通过电穿孔术和转导的方式将重组质粒导入感受态金黄色葡萄球菌细胞。2构建不同的启动子：mecA／pbpD杂合子，包括：不同启动子控制的金黄色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD，以及在同一启动子控制下的金黄色葡萄球菌mecA、松鼠葡萄球菌pbpD和nPB：TPase杂合子；目的是在已知的可比较条件下观察这些基因的表达。3提取细菌RNA，通过Northern blot在转录水平对成功构建重组mecA与pbpD区进行证实，并研究这些基因的表达。4制备细菌膜蛋白，应用ECL Western blotting analysis system进行Western blotting分析，在蛋白水平对成功构建重组mecA与pbpD区进行证实，并研究这些基因的表达。5对携带不同重组质粒的菌株RU4转导体进行在抗生素作用下的菌群谱分析，观察携带重组质粒的菌株COLmec~-和COLmec~-spac∷pbpB对抗生素的敏感性，以获得这些携带重组mecA／pbpD质粒菌株详实的耐药表型。6测定细菌生长曲线，观察携带重组质粒的COL mec~-pbpB基因缺陷突变株COL mec~-spac∷pbpB的生长情况，以阐明不同mecA／pbpD杂合子对宿主菌生长的支持作用。结果1本研究中，按特定目的成功构建了8个重组质粒，被置于几种特定的金黄色葡萄球菌背景下，观察金黄色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD在不同和相同转录水平的表达；比较了金黄色葡萄球菌mecA和松鼠葡萄球菌pbpD杂合子与其前体在相同转录水平的表达；探讨了mecA和pbpD基因中结构域的不同以及外源基因mecA和宿主固有基因pbpB之间的关系。2 Northern blot在RNA水平对成功构建重组mecA与pbpD区进行分析，发现代表各mecA／pbpD基因的转录子与相应的mRNA理论值符合；pSTSW6和pSTSW13携带的mecA／pbpD基因转录水平极低；pSTSW8和pSTSW8a，pSTSW14和pSTSW14a携带的基因在高水平转录；而pSTSW2C和p37MA在最高的水平表达。3 Western blotting与Northern blot结果相符，而且PBP2a蛋白分子量大小主要与nPB域相关。4仅有高表达的金黄色葡萄球菌mecA基因和松鼠葡萄球菌pbpD基因在没有宿主PBP2时能支持细菌生长和导致甲氧西林耐药，而其他的杂合子表达需要PBP2的存在。此外，金黄色葡萄球菌mecA比松鼠葡萄球菌pbpD更易导致耐药；原始的mecA基因比替换nPB域的杂合子更易导致耐药。5金黄色葡萄球菌mecA与松鼠葡萄球菌pbpD在耐药和支持细菌生长方面有高度的相似性，而前者更有效。nPB域在mecA基因进化过程中比TPase域更活跃，从而使金黄色葡萄球菌mecA产物功能结构最优化。结论1当金黄色葡萄球菌mecA、松鼠葡萄球菌pbpD和两者的杂合子在低和中等水平表达时，它们的生物功能完全依赖于功能性pbpB基因表达的存在；而宿主PBP2的生物学功能，仅可被过度表达的金黄色葡萄球菌PBP2a和松鼠葡萄球菌PBP4替代。2 mecA与pbpD基因产物的生物活性有赖于氨基酸组成的完整性和酶活性位点形成的正确性，并不由孤立的功能域所决定。3由看家基因松鼠葡萄球菌pbpD至耐药决定簇金黄色葡萄球菌mecA，经历了nPB和TPase两个功能域协同进化的过程。4尽管不能证明金黄色葡萄球菌PBP2a和松鼠葡萄球菌PBP4具有TGase活性，在苯唑西林存在时两者仍能“独立”的行使支持细菌生长和介导抗生素耐药性的功能。5抗生素压力和其它环境因素选择出最适的变异体以保障子代的生存和繁衍。6在葡萄球菌中还存在着另一具有TGase活性的蛋白质，当PBP2被β-内酰胺类饱和时，该蛋白替代PBP2为PBP2a充分发挥生物功能提供所需的TGase活性。