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橡胶树、银胶菊、橡胶草等植物中的橡胶结构为顺式-1,4-聚异戊二烯,而杜仲胶结构为反式-1,4-聚异戊二烯,其合成的关键是橡胶草在橡胶合成酶的催化作用下形成顺式-1,4-聚异戊二烯,而杜仲胶则在杜仲胶合成酶的作用下形成反式-1,4-聚异戊二烯。
二者具有相似的生物合成途径和共同的生物合成前体物质异戊二烯,本实验将橡胶草的橡胶合成酶基因TkCPT1导入杜仲,探讨在杜仲中产生顺式-1,4-聚异戊二烯橡胶的可能性,实验主要取得以下结果:
1.植物表达载体的构建
通过全基因合成TkCPT1基因,以pSH737载体为基础,通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切TkCPT1基因和pSH737载体,连接获得植物表达载体pSH737-TkCPT1。
2.转基因烟草植株的获得及农艺性状的测定
通过农杆菌介导法遗传转化烟草,获得转基因烟草12株,野生型烟草8株。对其进行农艺性状测定(株高和直径),测量结果显示,转基因烟草与野生型烟草的株高和直径两个性状上差异不显著,说明TkCPT1基因对烟草株高和直径没有影响。观察发现转基因烟草比野生型烟草提前一周开花,对单个株系(TP-1、TP-10、TP-19)进行荧光定量PCR鉴定,选取与烟草开花相关的基因(FT4、NFL1、MADS4、SOC1),这些基因在烟草开花时上调。结果表明,转基因株系中四个与烟草开花相关基因的表达量都高于野生型植株,并且,这三个转基因株系中开花基因的表达量与TkCPT1基因的表达量趋势一致,可能是TkCPT1基因的表达促进了这些开花基因的表达,使烟草提前开花。
3.杜仲遗传转化体系的优化
确定了培养14天的杜仲种子的下胚轴为最佳外植体;分化培养基配方为:MS(4.43g·L-1)+蔗糖(3%)+6-BA(2mg·L-1)+NAA(1.0mg·L-1)+琼脂粉(0.7%),pH6.0,分化率为45.8%,生根培养基配方为:1/2MS+1.0mg·L-1IBA,生根率较低,为6.7%;最佳农杆菌侵染浓度为OD600=0.6,浸染时间为30min。通过优化的遗传转化体系,获得独立的杜仲转基因株系76株。
4.杜仲再生芽的微嫁接
建立了杜仲再生芽微嫁接技术体系,解决杜仲再生芽生根困难问题,总嫁接69株,成活42株,嫁接成活率为60.8%,污染率为2.9%。
5.转基因杜仲与野生型杜仲代谢组分析
代谢组分析结果表明转基因杜仲与野生型杜仲差异物质共有58个,其中有43个上调、15个下调,其中与杜仲胶生物合成相关的差异代谢物有7种包括:两个单萜出现上升,甲羟戊酸、D-赤藓糖4-磷酸、一个半倍萜和两个三萜表现下调。
6.转基因杜仲胶结构分析
采用红外光谱对野生型和转基因杜仲胶的结构检测,转基因杜仲与野生型杜仲都存在反式-1,4-结构的特征峰,而转基因杜仲在这两个峰附近有两个区别于野生型的峰,具体的是否代表顺式-1,4-异戊二烯结构还有待进一步验证。
二者具有相似的生物合成途径和共同的生物合成前体物质异戊二烯,本实验将橡胶草的橡胶合成酶基因TkCPT1导入杜仲,探讨在杜仲中产生顺式-1,4-聚异戊二烯橡胶的可能性,实验主要取得以下结果:
1.植物表达载体的构建
通过全基因合成TkCPT1基因,以pSH737载体为基础,通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切TkCPT1基因和pSH737载体,连接获得植物表达载体pSH737-TkCPT1。
2.转基因烟草植株的获得及农艺性状的测定
通过农杆菌介导法遗传转化烟草,获得转基因烟草12株,野生型烟草8株。对其进行农艺性状测定(株高和直径),测量结果显示,转基因烟草与野生型烟草的株高和直径两个性状上差异不显著,说明TkCPT1基因对烟草株高和直径没有影响。观察发现转基因烟草比野生型烟草提前一周开花,对单个株系(TP-1、TP-10、TP-19)进行荧光定量PCR鉴定,选取与烟草开花相关的基因(FT4、NFL1、MADS4、SOC1),这些基因在烟草开花时上调。结果表明,转基因株系中四个与烟草开花相关基因的表达量都高于野生型植株,并且,这三个转基因株系中开花基因的表达量与TkCPT1基因的表达量趋势一致,可能是TkCPT1基因的表达促进了这些开花基因的表达,使烟草提前开花。
3.杜仲遗传转化体系的优化
确定了培养14天的杜仲种子的下胚轴为最佳外植体;分化培养基配方为:MS(4.43g·L-1)+蔗糖(3%)+6-BA(2mg·L-1)+NAA(1.0mg·L-1)+琼脂粉(0.7%),pH6.0,分化率为45.8%,生根培养基配方为:1/2MS+1.0mg·L-1IBA,生根率较低,为6.7%;最佳农杆菌侵染浓度为OD600=0.6,浸染时间为30min。通过优化的遗传转化体系,获得独立的杜仲转基因株系76株。
4.杜仲再生芽的微嫁接
建立了杜仲再生芽微嫁接技术体系,解决杜仲再生芽生根困难问题,总嫁接69株,成活42株,嫁接成活率为60.8%,污染率为2.9%。
5.转基因杜仲与野生型杜仲代谢组分析
代谢组分析结果表明转基因杜仲与野生型杜仲差异物质共有58个,其中有43个上调、15个下调,其中与杜仲胶生物合成相关的差异代谢物有7种包括:两个单萜出现上升,甲羟戊酸、D-赤藓糖4-磷酸、一个半倍萜和两个三萜表现下调。
6.转基因杜仲胶结构分析
采用红外光谱对野生型和转基因杜仲胶的结构检测,转基因杜仲与野生型杜仲都存在反式-1,4-结构的特征峰,而转基因杜仲在这两个峰附近有两个区别于野生型的峰,具体的是否代表顺式-1,4-异戊二烯结构还有待进一步验证。