论文部分内容阅读
隐花色素作为蓝光受体可以介导蓝光调控的基因表达从而产生光形态建成的反应。隐花色素 CRY2 与 CIB1(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 1)发生蓝光特异性地相互作用,调节CIB1的转录活性,促进FT(Flowering Locus T)的转录,从而促进成花起始。然而cib1单突变体拟南芥没有比野生型晚花,表明还存在CIB1的功能冗余蛋白。通过系统发生分析,与CIB1亲缘关系相近的蛋白被发现并分别被命名为 CIB2,CIB3,CIB4,CIB5,CIL1 和 CIL2。CIB2,CIB4,CIB5和CIL1的过表达拟南芥都有早花表型,而CIB3(At3g07340)过表达的拟南芥却没有明显的早花表型。本研究中,我们构建了 pDT7G-ACT2::CIB3-MYC-UBQ10::cGR-CRY2双价表达载体,分别转化rdr6和cry2突变体,调查过表达转基因植株开花时间的变化,研究CIB3在长日照下对拟南芥开花时间是否具有调节作用,并且明确这种调节作用是否依赖于CRY2,是否依赖于正确定位于细胞核中的CRY2。具体研究结果如下:1.双价表达载体构建和转基因拟南芥鉴定利用 Infusion 技术,构建双价载体 pDT7G-ACT2::CIB3-MYC-UBQ10::cGR-CRY2 并分别转化rdr6(RDR6基因失能突变体,能够削弱转录后基因沉默)和cry2突变体,获得 CIB3-MYC(MYC,human cellular homolog of avian myelocytomatosis virus)和cGR-CRY2共同稳定表达的转基因拟南芥,分别以(CIB3-CRY2)/rdr6和(CIB3-CRY2)/cry 表示。2.转基因T3或T4代拟南芥开花时间表型鉴定在长日照下培养转基因拟南芥,分别以30 mM Dex(Dexamethasone)和相应的Mock溶液处理,调查其达到开花的天数和叶片数。结果显示,cGR-CRY2/rdr6的开花时间在Dex和Mock处理之间没有明显差别,说明核内CRY2剂量的增加,并没有促进开花的功能。(CIB3-CRY2)/rdr6植株开花时间比对照cGR-CRY2/rdr6稍早,但在Dex和Mock处理之间没有明显差别。有趣的是,(CIB3-CRY2)/cry2开花时间明显早于对照cGR-CRY2/cry2和cry2的开花时间,而且其开花时间在Dex和Mock处理之间没有明显差别,说明CIB3具有不依赖于CRY2的促进开花的功能。3.CIB3过表达转基因拟南芥中开花基因的mRNA表达变化利用 QPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)技术,分析(CIB3-CRY2)/dr6和(CIB3-CRY2)/cr2 中开花基因 FT(FloweringLocusT)和FLC(FLOWERING LOCUS C)的mRNA表达与相应对照植株中的mRNA的表达变化。结果显示,在(CIIB3-CRY2)/rdr6中,CIB3促进FT的转录,在表达峰值上达到对照中的两倍之多,但在一昼夜内,FTmRNA的表达相位没有发生变化。同时,在(CIB3-CRY2)/rdr6中,FLCmRNA的表达量与对照相比受到了一定程度的抑制。FT mRNA 的表达相位在(CIB3-CRY2)/cy2和对照 cGR-CRY2/cry2,Co14之间存在差异。在(CIB3-CRY2)/cry2中,FTmRNA分别在光下和暗中出现一次表达高峰,在光下的表达高峰比其在对照植株中的表达高峰提前6小时出现。同时,在(CIB3-CRY2)/cry2中,FLCmRNA的表达量相对于对照和Co14中的都一定程度地受到了抑制。4.CIB3与CRY2蛋白相互作用的验证酵母双杂交鉴定结果显示,无论在蓝光还是黑暗下,CIB3与CRY2蛋白都不发生相互作用在人胚肾细胞(HEK293T)中表达CIB3与CRY2,Co-IP(Co-Immunoprecipitation)鉴定结果显示,二者也不存在蛋白的相互作用。这与已报道的通过体外Pull-down实验证实的CIB3与CRY2发生蛋白质相互作用的实验结果不一致。