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目的探讨具有祛瘀化痰之效的丹瓜方含药血清通过调控AMP/ATP-AMPK-HMGR信号通路改善胰岛素抵抗及脂质堆积的作用机制,为胰岛素抵抗的基础研究及中医药治疗提供实验依据。方法1、用0.25 mmol/L软脂酸和4 g/L的葡萄糖诱导HepG2细胞241h,建立胰岛素抵抗合并脂质堆积模型,运用MTT法检测细胞活性,油红O染色观察脂质堆积情况,葡萄糖氧化酶法检测糖耗量等实验方法验证造模成功。2、含药血清的制备:适应性喂养18只SPF级SD大鼠1周后,随机分为正常组、二甲双胍组、丹瓜方组。药物干预按成人60 kg计,大鼠与成人等效比按5.00计,大鼠灌胃量按成人3倍计,经换算二甲双胍组和丹瓜方组按10mL/kg灌胃给药,正常组给予同体积的无菌水灌胃7天,于第8天取各组的含药血清,冷藏备用。3、将实验分为5组:空白组、模型组、二甲双胍组、5%丹瓜方组、10%丹瓜方组,根据分组情况同时予诱导液和大鼠血清进行干预24h。用葡萄糖氧化酶法检测培养上清液中残存葡萄糖朔评,计算糖耗量及胰岛素敏感指数,通过油染红O色观察各组细胞内脂滴情况,用高效液相色谱法测AMP/ATP,实时荧光定量PCR检测AMPKα、HMGR mRNA的表达,蛋白印迹法检测AMPKα、P-AMPKα、HMGR蛋白的表达量。结果1.模型建立:用0.25 mmol/L软脂酸与4 g/L糖浓度干预HepG2细胞24 h后,MTT细胞活性实验结果显示,与正常组相比,细胞活性无明显下降(P>0.05);油红O染色后可见细胞内大量红色脂滴呈串珠样排列,部分融合成较大的脂滴;用葡萄糖氧化酶法测定,葡萄糖消耗量显著降低(P<0.01),胰岛素敏感性下降(P<0.01),表示成功建立胰岛素抵抗模型。2.葡萄糖消耗量与胰岛素敏感指数:与正常组相比,模型组的葡萄糖消耗量明显减少(P<0.01),胰岛素敏感指数明显降低(P><0.01);与模型组相比,丹瓜方组与二甲双胍组的葡萄糖消耗量均明显增加(P<0.01),胰岛素敏感指数均提高(P<0.01),其中二甲双胍组、5%丹瓜方组、10%丹瓜方组的葡萄糖消耗量无明显差异(P>0.05),二甲双胍组与10%丹瓜方组的胰岛素敏感指数均高于5%丹瓜方组(P<0.01)。3.油红O染色:与正常组比较,模型组红O染色后观察的细胞内脂滴明显增多且密集;与模型组相比,丹瓜方组与二甲双胍组油红O染色后观察的细胞内脂滴明显减少,分布离散,其中以10%丹瓜方组减少最为明显。4.高效液相色谱法测AMP/ATP:与正常组相比,模型组AMP/ATP比值无明显差异(P>0.05);与模型组和正常组相比,二甲双胍组和丹瓜方组AMP/ATP比值无明显差异(P>0.05),但药物组均值要高于模型组和正常组。5.qPCR:AMPKα、HMGRmRNA的表达:与正常组相比,模型组的HMGRmRNA表达显著升高(P<0.05),AMPKαmRNA表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组、5%丹瓜方组和10%丹瓜方组的HMGRmRNA的表达明显降低(P<0.05),AMPKαmRNA达显著升高(P<0.05);二甲双胍组、5%丹瓜方组、10%丹瓜方组的AMPKα、HMGRmRNA表达无明显差异(P>0.05)。6.Western blot:与正常组相比,模型组AMPKα、P-AMPKα蛋白表达降低(P<0.05),HMGR表达增多(P<0.05);与模型组相比,二甲双胍组和丹瓜方组AMPKα、P-AMPKα蛋白表达增多(P<0.05),HMGR蛋白表达降低(<0.05);其中二甲双胍组、10%丹瓜方组的P-AMPKα蛋白表达较5%丹瓜方组明显增多(P<0.05);5%丹瓜方组、10%丹瓜方组的HMGR蛋白表达较二甲双胍组明显降低(P<0.05),二甲双胍组和丹瓜方组AMPKα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.丹瓜方能增加胰岛素抵抗的HepG2细胞内葡萄糖消耗量,提高其胰岛素敏感性;2.丹瓜方能减少胰岛素抵抗的HepG2细胞内脂质堆积;3.丹瓜方改善胰岛素抵抗可能与激活AMP/ATP-AMPK-HMGR信号通路有关。