【摘 要】
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目的:本课题旨在探讨脱牙周膜细胞来源的细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）对再植牙周膜细胞的生物学效应及其相关通路研究,以期获得大量具有良好干性的牙周膜细胞。然后将该来源扩增的牙周膜细胞体外构建细胞膜片植入裸鼠体内,观察相应牙周组织再生情况,为未来牙周膜细胞治疗的临床应用提供实验依据和理论支持。材料与方法:1.组织块法原代培养人牙周膜细胞（human periodonta
【基金项目】
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国家自然科学基金（81570977）
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目的:本课题旨在探讨脱牙周膜细胞来源的细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）对再植牙周膜细胞的生物学效应及其相关通路研究,以期获得大量具有良好干性的牙周膜细胞。然后将该来源扩增的牙周膜细胞体外构建细胞膜片植入裸鼠体内,观察相应牙周组织再生情况,为未来牙周膜细胞治疗的临床应用提供实验依据和理论支持。材料与方法:1.组织块法原代培养人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）,第二代牙周膜细胞免疫组化进行来源鉴定。低密度连续培养14d构建单细胞膜片,进而脱细胞处理,采用光镜、SEM观察脱细胞前后ECM框架,免疫荧光染色鉴定ECM主要蛋白Col-I、Fibronectin表达。2.血平板计数法观察ECM对再植细胞增殖的影响,采用Western-blot观察MAPK信号通路分子的表达在细胞增殖中作用。流式细胞仪观察细胞周期和活性氧改变情况,运用Real-time PCR观察周期相关标记物基因表达情况。3.细胞接种培养7d后,加入或不加入抑制剂XAV-939,通过western-blot及Real-time PCR检测干性相关标记物Nanog,Sox-2,Oct-4表达情况。4.再植细胞7d后加入或不加入JNK抑制剂SP600125,β-catenin抑制剂XAV-939分别进行成骨染色及成骨基因和蛋白表达情况。5.比较不同介质培养来源的牙周膜细胞所构建的细胞膜片,Western-blot及real-time PCR分别检测细胞外基质蛋白及基因表达水平,组织学检测体内牙周再生状况。结果:1.第2代细胞连续培养14d,呈单层细胞膜片状态,脱细胞处理后光镜下未见细胞结构。扫描电镜显示脱细胞后完整交错排列的纤维网状结构,几乎未见细胞残留物。免疫荧光显示ECM主要蛋白Col-I,Fibronectin均得以大量保留,脱细胞前后无明显差异。2.与培养皿组相比,ECM组具有促进再植细胞增殖作用,且随着时间延长细胞内磷酸化MAPK水平逐步上升。ECM组再植细胞G0/G1期比例减少,S、G2/M期比例增加,周期相关蛋白基因Cdk-4,Cyclin表达上升,且细胞内活性氧水平下降。3.ECM促进细胞干性相关基因和蛋白表达,加入β-catenin抑制剂XAV-939后,均能促进细胞Nanog,Sox-2,Oct-4表达。Western-blot显示ECM促进activeβ-catenin表达,且该趋势与Nanog表达一致,加入β-catenin抑制剂后,activeβ-catenin和Nanog表达均升高。4.ECM促进再植细胞在成骨诱导条件下骨向分化,ALP染色和ARS染色均显示ECM较对照组更深。且该分化潜力可被β-catenin,JNK抑制剂抑制。对照组加入JNK抑制剂后,成骨分化未见明显影响。5.ECM扩增来源牙周膜细胞构建的膜片形态更为致密,高表达细胞外基质蛋白。体内植入后产生的纤维组织更致密,纤维伸展更有规则,厚度增加,且有类牙骨质/牙周膜组织形成。结论:1.组织块培养法可成功获取牙周膜细胞,细胞来源于中胚层。通过化学试剂处理可成功脱细胞处理从而获得结构较完整的ECM。2.ECM具有降低再植细胞内氧化应激水平,可能通过促进细胞周期改变和MAPK信号通路相关分子表达从而促进细胞增殖。3.ECM可能通过促进activeβ-catenin表达从而维持再植细胞干性,通过抑制activeβ-catenin表达和促进JNK表达促进再植细胞成骨分化。4.ECM来源的细胞形成的细胞膜片更致密,体内再生牙周组织能力更强。
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