糖尿病（diabetes mellitus）是胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱，临床以高血糖、高血脂、高粘血症为主要标志的全身慢性代谢性临床综合征。近年来，糖尿病本身及其并发症对人们的身心健康危害重大，已经成为现代流行疾病的第二杀手，仅次于癌症对人类的危害。因此，寻找更好的糖尿病药物和治疗方法是人们致力攻克的一大难题。全世界糖尿病患者人数呈逐年上升，并向低龄化趋势。随着社会进步和人们生活方式的变化，糖尿病已成为威胁人类健康的重要慢性非感染性流行疾病。　　 谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一种抑制神经递质-γ-氨基丁酸（GABA）的合成酶，有研究认为1型糖尿病的发病机理可能与细胞免疫有关，而GAD65很可能是此自身免疫反应中的始动靶抗原，因此通过抑制GAD65引起的特异性自身免疫反应，即有可能预防和治疗1型糖尿病。　　 胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1），又称促胰岛素激素，它是一种通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用而使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增强的一种小肽。GLP-1还能减少胰岛细胞损伤，改善胰岛细胞结构，修复胰岛β细胞功能，促进胰岛β细胞再生，提高胰岛细胞活力并延长其寿命，抑制胰升糖素的释放，调控胰腺β细胞特异基因表达并通过这种基因调控改善葡萄糖转运和代谢，提高β细胞对葡萄糖的反应性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能。GLP-1被认为是一种“治标治本”的糖尿病治疗新物质，对于糖尿病的治疗具有重要意义。　　 天然的GLP-1很快被体内特异性二肽酶Ⅳ（DPPⅣ）降解而失活。本研究所使用的GLP-1基因在保证生物活性不受影响的前提下消除了二肽酶Ⅳ（DPPⅣ）位点和基因内部的胰蛋白识别位点，使其可用于口服或食用。为综合GAD和GLP分别对1型和2型糖尿病的预防和治疗效果，并确保其食用后各自在体内高效发挥作用，构建融合基因时在GAD和GLP基因间添加了两个胰蛋白酶的识别位点，以保证食用后在肠道内形成的有独立活性的GAD和CLP多肽。　　 本研究选用的载体是无抗生素选择性标记基因的植物表达载体pX6，使用Marker-Free载体获得无抗生素选择性标记的植物，可以消除公众的安全性顾虑以及保证环境释放的安全性。将构建好的GAD-GLP-1融合基因克隆到表达载体pX6，构建了植物表达载体pX6-GAD-GLP-1，并转化农杆菌LBA4404菌株，构建了植物转化用的工程农杆菌。对影响黄瓜子叶节经器官发生途径诱导丛生芽形成和与农杆菌介导法转化黄瓜频率有关的重要因素进行研究和优化。结果表明黄瓜自交系2M1用4天苗龄的子叶节作为外植体，农杆菌浸染15min，共培养2天，出芽率最高。　　 通过农杆菌介导法、花粉管通道法和floral dip法对黄瓜自交系2M1和P2进行转化。经PCR检测及Southern斑点杂交检测，共获得15株含有外源基因GAD-GLP-1的转基因植株。其中，农杆菌侵染的转化率为0.25％，花粉管通道法的转化率为0.1％，首次成功应用在黄瓜遗传转化中的floral dip法的转化率为0.6％。　　 将获得的转基因植株经过β-雌二醇的诱导后，得到了Marker-free转基因植株。进行western blot分析，有2株植株呈阳性结果，分别命名为F22，A53。　　 以A53植株为材料，将黄瓜果实粉碎，并提取总蛋白，其浓缩物溶解液和果实粉碎物溶解液分别灌喂高血糖Wistar大鼠。结果发现两个处理组口服给药20天后，高血糖大鼠的血糖值均有所下降，从23.8±9.5mM降低到13.2±2.4mM和12.9±2.8mM，而正常对照组和0.9％NaCl对照组的血糖值在实验前后均无明显变化。表明通过给高血糖大鼠灌服GAD-GLP-1蛋白后，在体内降解为GAD、GLP-1单体，并且被肠道部分吸收，在一定程度上能够降低高血糖大鼠的血糖水平。同时也改善了模型大鼠的饮食、饮水平衡。　　 为提高GLP-1在植物体内的表达量，本研究首次将10拷贝的GLP-1基因片段克隆到植物表达载体pX6，获得表达载体pX6-GLP-T。利用floral dip法转化拟南芥，得到了含有外源基因的转化植株10株。外源蛋白的表达情况尚在进一步检测。　　 为提高外源蛋白在植物中的表达量，避免发生基因沉默，本文从甜瓜中克隆了启动子DP。通过对gus报告基因表达水平的检测，研究了DP的活性。结果表明，DP为天然双向启动子，启动效率高于35S启动子，但是不适合将35S启动子和DP组合成双启动子启动下游基因的表达。