背景与目的肠粘膜屏障是机体防御的重要屏障。大量研究表明：烧伤、战创伤、大型手术等外科应激条件及炎性肠病（inflammatory bowel disease， IBD）、全胃肠外营养（totalparenteral nutrition，TPN）等慢性刺激下均可导致肠粘膜屏障功能障碍，造成肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症反应综合征，导致多脏器功能衰竭[1]。尽管针对多种急、慢性病理条件下肠粘膜屏障调控做了大量研究工作，但不同病理刺激下肠粘膜屏障损伤与修复机制仍未阐明。近年来，研究者们逐渐认识到肠粘膜屏障功能调控与肠粘膜局部的缺氧关系密切，而这与肠粘膜独特的解剖结构有关。担负主要屏障功能的肠上皮细胞层直接面对肠腔内大量厌氧菌，而在上皮细胞下，是含氧量较高的弥漫的网状血管，这样从肠腔、肠上皮、上皮下组织到血管形成了明显的从低至高的氧浓度梯度。目前研究已证实在多种急慢性病理条件下，如感染性休克、内毒血症、缺血再灌注、炎症性肠病等情况，均会发生肠粘膜的局部缺氧，同时粘膜缺氧与炎症反应会协同作用，大量炎症因子会加剧缺氧造成的肠粘膜屏障功能损伤。目前研究表明，缺氧激活的上皮间淋巴细胞（Intraepithelial lymphocyte，IEL）分泌的γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）对肠粘膜屏障损伤发挥着关键作用。Shibahara等的研究显示，肠道急性缺血再灌注条件可激活IEL，促使IEL分泌IFN-γ来增加肠粘膜通透性，而肠道缺血再灌注损伤可加重肠道缺氧[2]。Roman等的研究也显示，缺氧刺激可激活淋巴细胞释放IFN-γ造成组织损伤[3]。一直以来，IFN-γ所致的肠粘膜屏障障碍被认为与其对肠上皮间紧密连接（tightjunction，TJ）以及肠上皮细胞凋亡的影响密切相关[4]。以慢性炎症和肠上皮细胞通透性增高为特征的炎症性肠病的发生与IFN-γ就有着紧密的联系。在克罗恩病的患者中就可以检测到肠粘膜中IFN-γ水平的升高，同时也可以发现促进肠通透性增高的紧密连接蛋白claudin-2表达水平的上升[5]。体外研究也证实：IFN-γ可通过抑制PI3K（phosphatidylinositol3-kinase）信号通路的激活，降低紧密连接蛋白occludin的表达，从而对肠上皮细胞通透性产生影响[6]。新近的研究发现IFN-γ对缺氧诱导因子1（Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的影响在由缺氧激活的IEL分泌的IFN-γ所致的肠粘膜屏障损伤发挥着重要作用[12，13]。HIF-1是一种随着细胞中氧浓度的变化而改变基因表达的转录激活因子，是具有调节细胞活性，促进其对缺氧环境的适应的最重要的调节因子。研究证实HIF-1可通过调节粘蛋白、肠三叶因子（intestinal trefoil factor，ITF）直接调节肠粘膜屏障功能、通过ecto-5’-nucleotidase（CD73）调节核苷酸代谢、通过p-糖蛋白（p-glycoprotein）来进行异物清除，通过血管舒张剂刺激磷蛋白（vasodilator stimulated phosphoprotein，VASP）来调节肠上皮细胞骨架，从而对肠粘膜屏障发挥保护作用[7-10]。HIF-1是由受氧浓度调节的HIF-1α亚单位，以及恒定表达的HIF-1β所组成的异二聚体。常氧情况下，HIF-1α的半衰期都非常短，能够被脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）识别并羟基化。被羟基化的HIF-1α与肿瘤抑制蛋白（von Hippel-Lindau protein，pVHL）结合，pVHL复合体能够富集elongin-C/elongin-B/cullin-2E3泛素连接酶，最终使HIF-1α由26S蛋白酶体介导降解[11]。目前研究显示，IFN-γ可通过多个因子来干预HIF-1的作用。有报道称IFN-γ可通过STAT1依赖性的方式在内皮细胞诱导脯氨酸羟化酶亚型之一PHD3的表达活性，而PHD通过以依赖氧浓度的方式羟基化HIF-1脯氨酰残基来调节HIF-1的表达量[12]。也有研究表明IFN-γ可通过抑制NF-кB活性来下调HIF-1的转录活性，NF-кB可能在HIF-1上游调控其表达；同时PHD可负性调节NF-кB通路的转录活性[13]。但是在肠上皮细胞中，IFN-γ是否通过影响HIF-1从而影响肠屏障功能，及其可能的机制目前还缺乏系统、深入地研究。因此本课题拟应用跨上皮电阻测定、蛋白印迹、染色质免疫共沉淀、基因转染等技术，从影响HIF-1活性最重要的两方面——HIF-1α表达量及转录活性，研究IFN-γ是否会对肠粘膜屏障保护因子HIF-1及其下游作用因子发挥作用，以及其发挥作用的机制，为肠粘膜屏障功能损害与修复机制提供理论依据。方法1．建立肠上皮细胞系HT-29缺氧模型及IFN-γ干预模型，通过transwell小室细胞培养、跨上皮电阻（TER）测定技术，了解缺氧及IFN-γ干预情况下肠上皮细胞TER的变化情况。2．在上述模型中，通过蛋白印迹以及RT-PCR技术，测定上述模型中肠粘膜屏障保护因子肠三叶因子（ITF）、粘蛋白（mucin-3）、CD73、CD55、PAFR的变化情况，探讨IFN-γ对缺氧肠粘膜屏障调节可能的机制。3．在上述模型中，通过蛋白印迹、RT-PCR以及染色质免疫共沉淀技术，测定IFN-γ对缺氧情况下肠上皮细胞系HT-29中的HIF-1α转录水平、蛋白合成及降解水平、转录活性水平的影响，探讨IFN-γ对HIF-1α调控的机制。4．利用DMOG （Dimethyloxaloylglycine）阻断HIF-1α最重要的降解通路O2/PHDs/pVHL途径，并构建针对PHD1、PHD2、PHD3的shRNA干预质粒，通过通过质粒转染、蛋白印迹、RT-PCR技术，进一步探讨IFN-γ促进HIF-1α降解的机制。结果1．IFN-γ参与了缺氧条件下肠上皮屏障功能损害缺氧+IFN-γ处理组TER较常氧处理组TER和缺氧处理组TER显著下降，差异有统计学意义（p<0.05）。从0h开始，对照组肠上皮细胞各时像点TER缓慢变化。缺氧处理组和缺氧+IFN-γ处理组TER呈逐渐降低趋势，降低幅度缺氧+IFN-γ处理组大于缺氧处理组。48h时常氧处理组TER（47.467±2.696）Ohms，缺氧处理组TER（43.867±2.651）Ohms，缺氧+IFN-γ处理组TER（31.4±4.239）Ohms，缺氧+IFN-γ处理组分别与常氧处理组和缺氧处理组比较，组间比较差异有统计学意义（t值分别为3.756和12.386，p值均小于0.05）。2．缺氧条件下IFN-γ下调HIF-1α介导的肠屏障保护因子ITF、mucin-3、CD73、CD55的表达缺氧处理组ITF、mucin-3、CD73、CD55、PAFR mRNA相对含量分别为与常氧处理组比较均明显升高，缺氧+IFN-γ处理组ITF、mucin-3、CD73、CD55显著低于缺氧处理组（p<0.05），但PAFR mRNA水平两组间差异无统计学意义（p>0.05）。缺氧处理后，肠上皮细胞ITF、mucin-3、CD73、CD55、PAFR（18.712±2.793，1.572±0.054，1.970±0.045，8.557±0.196，3.635±0.184）均较常氧处理组明显升高。缺氧+IFN-γ处理组ITF、mucin-3、CD73、CD55（9.106±0.765，1.083±0.061，0.500±0.013，3.217±0.111）与缺氧处理组相比，有显著下降（t值分别为7.417、13.405、70.415、53.052，p值均小于0.05），但是缺氧+IFN-γ处理组PAFR（3.409±0.093）与缺氧处理组无明显变化（t=2.459， p>0.05）。3．IFN-γ使缺氧条件下HIF-1α表达降低常氧处理组HIF-1α mRNA表达水平最低（1.000±0.124），缺氧处理组HIF-1α mRNA表达水平（4.514±0.575）以及缺氧+IFN-γ处理组HIF-1α mRNA（4.862±0.334）表达水平明显升高，与常氧处理组HIF-1α比较，差异有统计学意义（t分别为4.62，4.73，p<0.05）。缺氧处理组与缺氧+IFN-γ处理组比较，无明显统计学差异（p>0.05）。缺氧处理组HIF-1α蛋白含量较常氧处理组明显升高，缺氧+IFN-γ处理组与缺氧处理组相比则HIF-1α蛋白含量明显降低（p<0.05）。常氧处理组HIF-1α蛋白表达较低，缺氧处理组HIF-1α蛋白表达（4.694±1.373）明显升高，缺氧+IFN-γ处理组HIF-1α蛋白表达（1.307±0.377）虽仍高于常氧处理组，但较缺氧处理组低。缺氧处理组与缺氧+IFN-γ处理组比较，差异有统计学意义（t=5.32， p<0.05）。4．IFN-γ对缺氧情况下HIF-1α转录活性无明显影响染色质免疫共沉淀PCR分析结果示：缺氧处理组与缺氧+IFN-γ处理组inpu（t1.000与1.053±0.074）组间无明显差异。无抗体处理组Ab-中，无HRE条带。抗体处理组Ab+出现明显条带，其中缺氧处理组与缺氧+IFN-γ处理组（0.732±0.196、0.771±0.053）差异无统计学意义（p>0.05）。5．IFN-γ主要通过PHD2来调节HIF-1α表达分别用浓度为100μg/ml PHD抑制剂DMOG和20ng/ml IFN-γ处理后HT-29后，常氧处理组（Nx组）及IFN-γ处理组（Nx+I组）蛋白表达较低，DMOG处理组（DMOG组）及DMOG、IFN-γ处理组（D+I组）HIF-1α蛋白表达（5.495±0.736、5.789±0.657）明显升高，常氧处理组（Nx组）及IFN-γ素处理组（Nx+I组），DMOG处理组（DMOG组）及DMOG、IFN-γ处理组（D+I组）这两组间组间比较，差异无统计学意义（p>0.05）。为了进一步明确PHD的哪一亚型参与了IFN-γ对HIF-1α的调控，通过分别使用siR-PHD1、siR-PHD2、siR-PHD3转染HT-29细胞，转染24小时后再给予IFN-γ处理12小时，提取细胞总蛋白，进行western blot分析，结果见下图。siR-PHD1（2.534±0.235）、siR-PHD2（5.156±0.246）、siR-PHD3（4.236±0.423）处理，siR-PHD1+I（1.677±0.338）、siR-PHD2+I（5.275±0.248）、siR-PHD3+I（3.157±0.315）处理，与正常对照组相比均有不同程度增加，差异有统计学意义（p<0.05）。其中siR-PHD1+（I2.377±0.338）与siR-PHD1（2.534±0.235）、siR-PHD3+I（3.157±0.315）与siR-PHD3（4.236±0.423）比较减少，差异有统计学意义（t分别为0.975和0.614，p<0.05）。siR-PHD2+（I5.275±0.248）与siR-PHD2（5.156±0.246）差异无统计学意义（p>0.05）。结论1．IFN-γ参与了缺氧条件下肠上皮屏障功能损害，并与其抑制了受HIF-1α调控的ITF、mucin-3、CD73、CD55等肠屏障功能调节因子密切相关。2．IFN-γ对缺氧肠上皮HIF-1α及其下游调节因子的调节作用主要是通过减少HIF-1α蛋白表达量来实现的，其作用可能与减少HIF-1α的蛋白合成以及促进HIF-1α在缺氧情况下的蛋白降解有关，而与HIF-1α自身转录水平以及HIF-1α作为转录调控因子转录活性没有关系。3．给予PHD抑制剂DMOG可以抑制IFN-γ引起的细胞中HIF-1α蛋白表达的减少。沉默PHD2可以得到同样的阻断效果，沉默PHD1、PHD3对IFN-γ引起的细胞中HIF-1α蛋白含量的减少没有明显影响。提示IFN-γ对缺氧肠上皮细胞HIF-1α蛋白含量的减少可能与促进了PHD2相关的HIF-1α蛋白降解通路有关。