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金鱼(Carassius auratus)属于鲤科鲫属,作为鲫的变种因体型多样且色彩变化多端,深受大众喜爱市场前景良好。金鱼等鱼类的鳃小片在不同的溶氧环境中具有可塑性。常氧环境下鳃小片之间具有嵌入式细胞团,鳃部表面积较小;当水中溶氧量降低时,鳃小片间嵌入式细胞团(Inter Lamellar Cell Mass,ILCM)减少或消失,鳃丝上皮细胞变薄,鳃小片基部全部显现,表面积增大约7.5倍,从而提高鳃对水体中溶解氧的吸收能力。这一过程被称为鳃形态重塑,目前认为主要与细胞凋亡和细胞脱落有关,但其具体机制有待进一步研究。低氧诱导因子(Hypoxia-Inducible Factors,HIFs)是一类介导细胞低氧应答反应的关键转录因子,通过减少氧气消耗和增加氧气供应来调控细胞适应缺氧条件的基因表达。人们推测鳃形态重塑过程中HIF-1可能发挥了重要作用。粘附连接是E-钙黏蛋白(E-cadherin)介导的上皮细胞间粘附结构,不仅将相邻细胞依次连接起来,维持上皮细胞正常的形态和极性,而且参与细胞间及胞内的信号转导。E-cadherin的表达受到HIF-1及其靶基因Twist和Snail的调节。为了探究HIF-1/E-cadherin在金鱼鳃重塑过程中的作用,本实验主要运用免疫荧光、荧光定量PCR、酶活水平检测和Western Blot等技术进行深入分析,具体内容如下:1.低氧对金鱼细胞粘附E-cadherin的表达的影响分析将购自花鸟市场30条大小相近的健康金鱼进行分组,每组为6条,分别分为常氧生理盐水组(6-8 ppm),常氧+HIF-1α稳定剂DMOG组(40 mg/m L),低氧生理盐水组(1.8 ppm),低氧+蛋白酶体抑制剂Bortezomib组(1 mg/m L),低氧+HIF-1α反义核酸组(33 mg/mL),药物注射后置于15℃恒温淡水养殖8 h。MS222麻醉后解剖取完整鳃组织,剩余组织放入液氮保存。经4%PFA固定后的鳃组织,经过脱水干燥,样品镀膜后用电子显微镜观察发现低氧处理8 h或12 h后金鱼鳃组织ILCM细胞减少或消失,HIF-1α稳定剂DMOG处理会促进常氧状态下金鱼鳃组织ILCM减少,而bortezomib和HIF-1α反义核酸处理能够抑制低氧诱导的ILCM细胞减少,表明低氧可通过HIF-1影响金鱼鳃形态重塑过程。免疫荧光、组化和Western Blot分析表明,DMOG或低氧处理金鱼鳃组织中E-cad蛋白水平提高,而HIF-1α反义核酸组和bortezomib处理与低氧处理组相比无明显差异。通过克隆金鱼E-cadherin基因约2000 bp的启动子区域,对启动子转录位点进行了生物信息学分析,发现金鱼E-cad启动子区序列可能存在Twist,GCM-1和HOXB9等多个转录结合位点;同时,低氧处理可以提高Snail和E-cad的表达,但对Twist无影响。以上结果表明,与广泛报道的癌细胞EMT过程不同,低氧和HIF-1可促进金鱼鳃组织E-cad的表达。2.E-cad对金鱼鳃组织凋亡途径的影响细胞凋亡主要分为线粒体途径和死亡受体途径。在线粒体途径中,金鱼鳃组织凋亡相关的蛋白Bim和Caspase-3的表达水平明显高于其他组织,表明金鱼鳃组织具有较高的线粒体凋亡信号水平。在Bim蛋白的三种亚型(BimEL,Bim L和BimS)中,Bortezomib处理能够有效抑制低氧诱导的BimS蛋白水平上升,同时增加BimEL的表达。同时,Bortezomib处理和HIF-1α反义核酸处理均降低了金鱼鳃组织中Caspase-3水平。哺乳动物细胞的死亡受体凋亡途径中,E-cad/连环蛋白(β-catenin)可与死亡受体DR4/DR5结合,促进细胞凋亡。低氧诱导金鱼鳃组织Caspase-8酶活水平显著提高,同时死亡受体配体trail的表达水平在不同处理组之间无明显差异,我们推测Caspase-8酶活水平变化是由于E-cadherin(而不是配体Trail)表达水平的改变引起。Bortezomib处理降低金鱼鳃组织Caspase-8酶活水平,β-catenin的表达水平和β-catenin靶基因cyclinD-1的mRNA水平,表明低氧诱导的金鱼鳃组织E-cadherin表达水平上升,有可能促进死亡受体凋亡途径,而Bortezomib可通过抑制β-catenin水平阻碍这一过程。综上所述,低氧可以通过HIF-1诱导金鱼鳃组织E-cad的表达,激活ILCM细胞死亡受体凋亡途径,而Bortezomib可以通过Bim抑制细胞凋亡线粒体途径,通过β-catenin阻碍细胞凋亡死亡受体途径,从而调节鳃形态重塑过程。