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木聚糖是植物细胞壁的重要组成成分，结构错综复杂，自然环境下很难被降解。木聚糖酶能够有效地作用于木聚糖主链的β-1，4糖苷键，是水解木聚糖的关键酶。微生物源木聚糖酶在自然界分布最为广泛，通过纯培养技术分离到的活性高和稳定性好的优良菌株已被应用于食品、饲料、能源、纺织和造纸等工业中。但越来越多的试验证明，环境微生物绝大多数是不可培养的，如何发掘不可培养微生物的木聚糖酶基因资源，找到更具应用价值的新型木聚糖酶，一直是酶工程领域研究的热点。 为此本试验以实验室前期构建的湖羊Fosmid文库为对象，对筛选获得的18个木聚糖酶阳性克隆进行基因功能分析，并利用木聚糖酶（糖苷水解酶家族10和11）功能域通用引物，从麋鹿、澳洲马、湖羊、奶牛、熊猫和兔子消化道微生物基因组DNA中扩增木聚糖酶功能域基因片段，在研究木聚糖酶基因多样性的基础上，扩增木聚糖酶基因开放阅读框，以期获得具有应用潜力的新型木聚糖酶基因。 1、Fosmid文库中阳性克隆子的测序分析 经过ORF翻译和蛋白质功能预测，18个木聚糖酶阳性克隆测序共获得6个编码木聚糖酶的基因。ORF1和ORF2（命名为xyn-lxy）与不可培养细菌uncultured bacterium Contig1552来源的木聚糖酶基因相似性分别达到94.1％和97％; ORF3、ORF4和ORF5与Fibrobacter succinogenes subsp.S85来源的木聚糖酶基因相似性分别为39％、47％和76％; ORF6与不可培养的细菌unculturedbacterium LAB20来源的木聚糖酶基因相似性达到91.6％。xyn-lxy基因长度为1923 bp，含有起始密码子(ATG)和终止密码子（TAA），编码641个氨基酸，预测等电点和蛋白质分子量分别为4.95和71.27 kDa，属于糖基水解酶GH10家族。 2、xyn-lxy基因的克隆与表达 克隆木聚糖酶基因xyn-lxy，将其在大肠杆菌中进行表达。超声波破碎纯化后测得重组酶Xyn-LXY的蛋白质分子量为97kDa。酶学特性分析结果显示，Xyn-LXY最适反应温度为45℃，最适pH为6.0，最高酶活力为1360 U/mg，金属离子Mn2+对其具有促进作用。以山毛榉木聚糖为底物时，液相色谱分析结果显示， Xyn-LXY的水解产物主要是木二糖和木糖，每U Xyn-LXY木聚糖酶可生成0.251 mg木二糖和0.076 mg木糖。 3、木聚糖酶基因的多样性分析 采用GH10和GH11家族功能域通用引物分别从麋鹿、澳洲马和熊猫的粪便、奶牛和湖羊瘤胃内容物、兔子盲肠内容物的基因组DNA中扩增木聚糖酶基因片段，构建GH10和GH11家族功能域文库，从每个文库中随机挑取96个阳性克隆子进行测序，麋鹿、澳洲马、奶牛、湖羊、熊猫和兔子的GH10家族文库中分别有71，27，80，93，25和52个序列确认来自GH10家族;GH11家族文库中，麋鹿、奶牛、湖羊、熊猫和兔子分别有32、26、12、65，52条序列确认来自GH11家族，在澳洲马的GH11家族文库中，没有扩增到该家族的基因片段。 经NCBI数据库比对显示，GH10家族木聚糖酶基因主要是不可培养微生物来源（Uncultured organisms），其次是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);GH11家族木聚糖酶基因主要来自厚壁菌门、放线菌门和真菌(Fungi)。GH10家族文库中，麋鹿有69％的序列来自变形菌门，30％的序列来自放线菌门，其中假黄色单胞菌属为优势菌属;澳洲马有50％的序列被归类到放线菌门，25％的序列归类到变形菌门，15％的序列未被分类;奶牛和湖羊很相似，20％的序列来自拟杆菌门，80％的序列未被分类;熊猫有88％的序列来自变形菌门，未被分类的序列和归类到厚壁菌门的序列各占6％，兔子有75％和25％的序列被归类到拟杆菌门和厚壁菌门组成。GH11家族文库中被归类的序列很少，麋鹿有3条序列划分到放线菌门，1条序列被归类到真菌;奶牛有5条序列被归类到放线菌和厚壁菌，还有10条序列划分到真菌，湖羊有2条序列划分到放线菌门，5条序列归类到厚壁菌门，熊猫有12条序列划分到真菌，兔子被划分的27条序列全部来自厚壁菌门。 门水平划分并非包含基因文库的所有序列，对各物种GH10和GH11家族的OTU代表序列进行系统进化分析发现，大量序列单独成簇，说明动物消化道木聚糖酶基因具有新颖性，有较高的发掘价值。 4、xyn-fl全长序列扩增初步探索 从所有文库中选择OTU数量多，且与数据库相似性低的序列（兔子GH10-A3）作为全长基因扩增的原材料。利用基因步移法，经过3次巢式PCR反应扩增，拼接得到长度744bp的木聚糖酶基因（命名为xyn-fl）。由于侧翼扩增的序列还不完整，该基因在原核中表达未能表现出木聚糖酶的活性，后期研究需再进行扩增。