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细菌在常规的固体培养基上无法生长繁殖形成肉眼可见的微小菌落,但其仍然具有生命活动且能够进行新陈代谢,这种特殊的细胞状态被称为活的不可培养状态(viable but nonculturable state,简称为“VBNC状态”)。在食源性致病菌常规监测方面,由于VBNC状态细菌无法在固体培养基上形成菌落,因此传统的涂布平板检测法无法检测出VBNC状态细菌,极易造成VBNC状态细菌的漏检,对食品安全与人类健康造成严重威胁。近年来,速冻食品工业得到了较快的发展,成为我国传统食品产业化的重要途径之一。本文选题的实验体系为速冻食品中的速冻牛肉丸,牛肉丸中富含丰富蛋白质、氨基酸等各种营养成分,适合于食源性致病菌的生长繁殖。肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)是大肠杆菌中主要的一个致病亚型,其中E.coli O157:H7是EHEC的一个重要血清型,是最主要的食源性致病菌之一,其主要通过产生志贺毒素、溶血素和黏附素在肠道上皮细胞表面形成擦拭性(attaching and effacing,A/E)损伤,能够引起肠道疾病的典型症状以及致命性疾病,从而损害人体健康。此外,E.coli O157:H7也是牛肉类食品中最常见的食源性致病菌,而速冻食品加工过程中防腐剂、低温等胁迫因素易诱导E.coli O157:H7形成VBNC状态,成为速冻食品最主要的潜在安全隐患之一。因此,将研究对象确定为速冻牛肉丸食品体系中的E.coli O157:H7具有重要意义。本课题主要研究内容包括三个部分,分别为速冻牛肉丸培养体系中VBNC状态E.coli O157:H7的诱导、VBNC状态E.coli O157:H7分子生物学检测方法的建立以及VBNC状态E.coli O157:H7的转录组学分析研究。本课题分别在-20℃和4℃建立速冻牛肉丸低温诱导体系,通过涂布平板计数法在-20℃诱导152天后确认速冻牛肉丸中E.coli O157:H7进入不可培养状态,同时采用萘啶酮酸活菌直接计数法验证了不可培养状态的E.coli O157:H7为活菌状态,并测得活菌数即VBNC菌数为6.3×10~7 cells/mL,但是4℃速冻牛肉丸中E.coli O157:H7无法进入VBNC状态,其可培养数在诱导第156天依然保持在10~8 CFU/mL;本课题建立了与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)相结合的PCR分子生物学检测方法,通过科学有效的实验设计实现了常规PCR从定性检测到半定量检测的突破,并检测出速冻牛肉丸中VBNC状态E.coli O157:H7的菌数超过10~7cells/mL,同时也进一步验证了速冻牛肉丸中E.coli O157:H7进入了VBNC状态;采用转录组学方法对低温诱导进入VBNC状态的E.coli O157:H7与正常对数生长期细胞进行转录组测序与分析,得到两者间显著的差异表达基因,通过GO功能分析对实验中得到差异表达基因进行注释及其功能的预测,再通过KEGG Pathway分析对实验中得到差异表达基因进行代谢途径的分析预测,从而推测出在低温诱导条件下进入VBNC状态的E.coli O157:H7中存在的相关分子机制。KEGG Pathway分析结果在转录水平层面上说明了在-20~oC诱导进入VBNC状态的E.coli O157:H7胞内蛋白质合成不但没有停止,反而合成了相当数量的蛋白质来维持VBNC状态的机能代谢过程和生命活动,而VBNC细胞的形成与这些蛋白质的合成密切相关。本课题的研究思路是:从VBNC状态E.coli O157:H7的低温诱导开始着手,到VBNC状态细胞的快速检测方法建立,最后采用转录组学方法探究VBNC状态细胞中存在的相关分子机制。本课题通过对VBNC状态E.coli O157:H7的外在表征与内在机制的研究,以期提供有效可行的食源性致病菌检测参考方案,阐述VBNC状态细胞的相关机制,从而为解决VBNC状态细胞威胁人体健康等安全问题提供科学的参考依据。