阿尔茨海默症（AD）是一种神经退行性疾病,其特征为认知能力进行性丧失。65岁及以上老年人为高发群体。随着世界人口老龄化程度加剧,AD跃然成为当下最昂贵、致命和高负担的疾病之一。AD病因复杂,其详细发病机制尚未探明。研究人员提出了许多关于AD发病机制的假说,并开发了药物用于治疗AD。然而这些药物都只能暂时缓解患者的部分症状,不会改变疾病的基本过程,甚至会给患者带来严重的副作用。因此,亟待研发能更有效治疗AD的药物。近年来,传统中药衍生的天然产物因具有药理活性多样、无明显毒副作用的特点,引起了科学家的广泛关注。基于课题组前期对大量天然产物的筛选研究和调研发现,连翘有效成分连翘酯苷A（FA）可能具有治疗AD的潜力。FA是一种活性苯乙醇苷,具有多种有益的药理特性,包括抗炎、抗氧化和神经保护等。但目前尚缺乏FA对AD治疗机制的系统性研究。为了探索FA对AD的作用功效和机制,本研究通过β淀粉样蛋白（Aβ）1-42诱导的N2a细胞模型、脂多糖（LPS）诱导的BV2细胞模型和APP/PS1双转基因小鼠模型,对FA的保护作用进行评估,采用label-free定量蛋白质组学技术对其作用机制进行深入探究,并在APP/PS1双转基因小鼠模型和erastin诱导的HT22细胞模型中对作用机制进行系统地验证。具体研究内容如下:1、FA对Aβ1-42诱导的N2a细胞模型和LPS刺激的BV2细胞模型的神经保护作用的研究。在Aβ1-42诱导的N2a细胞模型中,FA能提高N2a细胞的活力,但未对健康细胞产生明显影响。JC-1荧光染色确定了FA能改善线粒体膜电位失衡。此外,FA显著抑制了细胞内活性氧（ROS）的产生,保护神经细胞免受氧自由基的攻击,进而减少了丙二醛（MDA）的产生。在LPS刺激的BV2细胞模型中,FA抑制了一氧化氮（NO）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的产生。通过两种神经细胞模型证实了FA能显著抑制Aβ1-42诱导的氧化损伤和LPS引起的炎症反应。2、FA对APP/PS1小鼠行为学和相关病理的影响。首先通过小鼠体重变化、脏器指数和H＆E染色评估FA对小鼠的安全性。结果表明,在饲养和给药期间,各组小鼠体重均在正常范围内波动;FA未改变小鼠的脾脏指数,但降低了肝脏指数和肾脏指数,使其更接近健康小鼠;FA未引起小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和大脑发生明显病变,说明FA具有良好的安全性。通过Y迷宫实验和水迷宫实验证实了FA能提高小鼠的学习和记忆能力。小鼠病理分析结果说明,FA给药后能抑制AD小鼠大脑海马区Aβ沉积,减少tau蛋白的异常磷酸化水平,并下调小鼠大脑中神经元凋亡水平,说明FA能够缓解APP/PS1小鼠的记忆障碍和病理特征。3、基于蛋白质组学研究FA治疗AD的作用机制。首先,利用label-free定量蛋白质组学分析确定了FA可能通过激活多巴胺下游级联信号进一步调节炎症反应,改善AD小鼠的病理情况,发挥神经保护作用。后续,通过免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附测定和western blot检测了APP/PS1小鼠大脑中多巴胺能和神经炎症信号通路。结果表明,给药治疗6周后,FA上调大脑中环磷酸腺苷（c AMP）的表达,并激活下游c AMP反应元件结合蛋白（CREB）级联信号通路。此外,FA抑制了小鼠大脑海马区和皮层区离子化钙结合衔接分子1（Iba1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,使得IκB激酶（IKK）/NF-κB抑制剂（IκB）/核因子-κB（NF-κB）信号通路失活,神经胶质细胞释放的单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、IL-1β和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎因子含量显著降低,转化生长因子-β（TGF-β）、IL-4和IL-10等抗炎因子分泌水平显著上调,说明FA显著抑制了APP/PS1小鼠大脑中的炎症反应。4、FA对APP/PS1小鼠和erastin诱导的HT22细胞模型中铁死亡的影响。大量研究证实了铁死亡在AD发病机制中的重要作用,并在大脑中和神经炎症以双向关系交织在一起。为了探究FA对铁死亡的调节作用,通过APP/PS1小鼠和erastin诱导的HT22细胞模型对铁死亡相关指标进行检测,并结合分子对接,模拟FA的作用靶点。结果表明,在APP/PS1小鼠大脑中,FA激活了核因子红系2相关因子2（Nrf2）信号,提高了NAD（P）H醌脱氢酶1（NQO1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）等抗氧化蛋白的含量,并通过调节转铁蛋白受体（TFRC）、二价金属离子转运蛋白-1（DMT1）、铁重链（FTH）和铁轻链（FTL）的表达,改善大脑中铁的代谢水平。在HT22细胞模型中,FA抑制了由erastin诱导的细胞死亡,提高谷胱甘肽（GSH）的含量,降低细胞内ROS和MDA的表达水平。TEM结果表明,FA缓解了由erastin诱导的线粒体体积减小、线粒体嵴断裂等铁死亡标志性变化。Western blot结果指出,FA能上调HT22细胞中的Nrf2和下游抗氧化蛋白的表达水平,改善细胞中的铁代谢,实验结果与APP/PS1小鼠模型相一致。分子对接结果说明,FA对GPX4具有较强的亲和力,最佳结合能为-6.35kcal/mol,上述研究说明FA能够抑制APP/PS1小鼠和erastin诱导的HT22细胞模型的铁死亡。5、结合si RNA转染技术在erastin诱导的HT22细胞模型中探究FA的作用靶点。为了研究FA对AD中神经炎症发生和发展的抑制作用是否建立在其对铁死亡的调控基础上,对erastin诱导的HT22细胞模型中炎症相关介质进行检测,结果表明,FA能抑制IKK/IκB/NF-κB信号通路,降低促炎细胞因子,如IL-1β和TNF-α等的分泌,并促进抗炎细胞因子IL-4和IL-10的释放。si RNA转染实验结果显示,GPX4和Nrf2基因被沉默后,FA对erastin诱导的HT22细胞模型中铁死亡和炎症相关蛋白的调节能力被显著抑制,说明FA通过靶向Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡介导的神经炎症,从而发挥神经保护作用。综上所述,本研究采用Aβ1-42诱导的N2a细胞模型、LPS诱导的BV2细胞模型、erastin诱导的HT22细胞模型和APP/PS1双转基因小鼠模型,从体内和体外两方面对FA的保护作用和机制进行了系统且深入的探究,明确了FA可以通过激活Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡和神经炎症,从而缓解AD症状,为进一步研究FA对AD的治疗机制和相关药物研发提供了理论基础。