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根管治疗术是牙髓病与根尖周病最常用的临床治疗方法,然而由于多样的感染细菌、复杂的根管系统和不当操作等原因,使得一些患牙经过反复治疗仍然迁延不愈,即成为所谓的顽固性根尖周炎。而形成顽固性根尖周炎的主要原因就是在其患牙根尖形成了根尖外的生物膜。根尖外生物膜是细菌粘附于根尖牙骨质上形成的细菌群落,由多种细菌镶嵌于蛋白质和多糖的基质中形成。根尖外生物膜中的细菌以革兰氏阳性厌氧菌或兼性厌氧菌为主,比如粪肠球菌、衣氏放线菌、血链球菌等等。其中粪肠球菌是根尖病变中最常被检出的细菌,含有脂磷壁酸、溶细胞素、肽聚糖等多种毒力因子导致炎症的产生,并且能够促进生物膜的形成,使细菌具有更强的致病性并且难以被去除。衣氏放线菌可能与慢性根尖炎症有关,导致窦道产生。血链球菌也常在根尖部检出,能够造成根管的持续感染。而生物膜的形成更能够延缓抗菌素的扩散,增强细菌的耐药性,使细菌更难以杀灭;同时也使得细菌的毒性产物更易聚集,提高细菌毒性。因此在治疗顽固性根尖周炎的过程中如何有效得去除根尖周的生物膜变得尤为重要。临床上治疗顽固性根尖周炎最常用的方法是进行根尖切除术。根尖切除术是一种根管外科手术,主要应用于传统根管治疗术无法治愈的情况下,用手术的手段清除根尖外的生物膜和感染组织,阻断炎症来源,从而达到消除症状,保存患牙的目的。要达到这一目的,要合理设计手术切口;刮除病变组织、根尖外细菌以及超充材料,保证感染去除;切除根尖3mm,再对根尖处进行倒预备,根尖倒充填来封闭根管系统。然而进行根尖切除就必定会导致牙根长度的减少,使得牙根的支持力下降,尤其不适用于牙周炎患者,以及要做后期修复治疗的患者。因此考虑利用其它方法,在不进行根尖切除的情况下去除根尖外生物膜,达到治愈患牙的效果。Er:YAG激光自其应用于牙体组织开始,就因热损伤小、能精确切割、减少出血、有抗菌能力等优点而被广泛应用。研究发现,Er:YAG激光对于根管内包括粪肠球菌在内的细菌都具有很好的杀灭作用。尤其是当其与根管冲洗液联合应用的时候,激光激发冲洗液产生空气泡沫和脉冲压力波,进一步发挥激光和冲洗液的杀菌效果,能够有效去除根尖和牙本质小管内的细菌。同时Er:YAG还能够减少细菌毒素在牙骨质中的扩散,抑制生物膜的再生。然而国内外对于Er:YAG激光联合根管冲洗剂在根尖外的应用研究还很少。因此,本文考虑在体外建立多细菌生物膜,以Er:YAG激光联合多种根管冲洗液进行处理,观察细菌形态和数量的改变,为Er:YAG激光应用于根尖外生物膜做参考。一、多细菌生物膜在牛牙骨质片上的形成过程研究选择粪肠球菌、血链球菌以及衣氏放线菌作为研究细菌,通过绘制它们的生长曲线,确定在牙骨质片上进行细菌接种的顺序。将牛牙牙根切开,切下牙根表面的牙骨质,形成牙骨质片,消毒后接种细菌。先接种衣氏放线菌培养48h后,再接种另外两种细菌进行共同培养。并在培养期间,每天拿取一个牙骨质片样本用扫描电子显微镜(SEM)观察,确定选择的细菌确实可以在体外牛牙骨质片上形成生物膜,并且了解这种生物膜的形成过程,以及生物膜成熟所需要的培养时间。二、Er:YAG激光联合几种根管冲洗剂对体外多细菌生物膜作用的扫描电子显微镜观察根据实验一的研究建立体外根尖多细菌生物膜模型。选用几种具有消毒作用的冲洗剂:次氯酸钠(sodium hypochlorite,Na Cl O)、洗必泰(chlorhexidine,CHX)以及强酸性电解质水(strong acid electrolyzed water,SAEW)。将牙骨质片样本随机分为四个实验组和两个对照组。四个实验组分别为A(5.25%Na Cl O/Er:YAG)、B(0.5%Na Cl O/Er:YAG)、C(2%CHX/Er:YAG)和D(SAEW/Er:YAG),E(生理盐水)和F(5.25%Na Cl O)分别为阴性对照组和阳性对照组。每组又分为三个亚组,即处理时间分别为30s、1min和3min。按分组进行相应处理后用4%的多聚甲醛固定样本12h,然后用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液脱水一次各15min,100%酒精脱水两次每次15min。待样本干燥后喷金,用SEM进行观察。结果发现除了生理盐水组之外,其他各组的细菌的数量以及形态都发生了变化,但不同组间的变化程度有所不同。提示Er:YAG激光与几种根管冲洗剂联合对于根尖外生物膜有杀菌作用,但效果与根管冲洗剂的种类以及作用时间有关。三、Er:YAG激光联合几种根管冲洗剂对体外多细菌生物膜的细菌定量研究在实验二的基础上,具体研究各组细菌数量的变化情况,对处理组的杀菌效果进行定量分析。提取粪肠球菌的DNA,进行普通PCR、琼脂糖凝胶电泳、切胶、胶回收,回收所得的DNA片段作为实时荧光定量PCR的标准品,制作细菌的标准曲线。同时提取各样本上经处理后的DNA,进行实时荧光定量,根据标准曲线确定各组处理后所余细菌的数量。结果表明5.25%Na Cl O+Er:YAG组在30s和3min时与阳性对照组的效果相当,而在1min时效果优于5.25%Na Cl O组。而0.5%Na Cl O+Er:YAG组和SAEW+Er:YAG组虽然30s时杀菌效果略次于5.25%Na Cl O组,但在1min与3min时效果可以达到5.25%Na Cl O组水平。CHX+Er:YAG组杀菌效果相对上述几组杀菌能力较弱,无法达到阳性对照组的杀菌效果,但与阴性对照组相比,仍能起到作用,有一定的杀菌能力。