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【研究背景和意义】免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint blocker,ICB),如CTLA4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)或PD1(Programmed cell death 1)抗体,已经在晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等多种肿瘤病人中取得了良好的治疗效果,但目前仅限于一小部分病人。这种选择性疗效的内在机制仍不清楚,而且,如何预测免疫检查点抑制剂的治疗效果仍是一个急需解决的问题。【研究假说和目的】本论文的假说:激活抗肿瘤免疫反应和肿瘤血管正常化共同介导了免疫检查点抑制剂对癌细胞的清除作用。本论文的研究目的:(1)建立对免疫检查点抑制剂敏感与耐受的肿瘤模型;(2)阐明免疫检查点抑制剂选择性疗效的内在机制;(3)寻找新型的生物标志物来预测免疫检查点抑制剂的疗效。【研究方法】在原位接种乳腺癌(EO771、4T1、MCa P0008)、自发性乳腺癌(MMTV-Py VT)和皮下接种结肠癌(MCa38、CT26)模型中,(1)通过腹腔给予ICB或同型对照抗体治疗后,测量肿瘤大小并称取肿瘤重量,建立对ICB不同敏感度的肿瘤模型;(2)通过免疫组化的方法,分析ICB或相应同型对照治疗后,肿瘤血管形态与功能的变化;(3)利用q PCR技术,检测肿瘤组织中促血管或抑制血管生成因子的基因表达水平;(4)利用流式细胞分析仪,分析ICB或相应同型对照治疗后,肿瘤浸润免疫细胞的组成与表型;(5)通过anti-CD4或anti-CD8抗体去除特定T淋巴细胞后,检测肿瘤生长曲线和分析血管功能的变化;(6)通过胞内染色并结合流式细胞术,检测ICB治疗对肿瘤浸润T淋巴细胞IFN-γ表达的影响;(7)利用anti-IFNγ抗体阻断及IFN-γ受体基因敲除小鼠,分析IFN-γ信号通路在CTLA4抗体治疗中的作用;(8)寻找有效的生物标记物来区分对CTLA4抗体治疗“有反应”及“无反应”的肿瘤;(9)通过时间点实验,分析CTLA4抗体治疗影响肿瘤血管功能与肿瘤生长的时间曲线;(10)结合多普勒超声与3D成像技术,在体检测CTLA4抗体治疗对肿瘤血管功能的影响。【研究结果】(1)不同肿瘤模型对ICB治疗的敏感性不同,其中乳腺癌模型EO771、MMTV-Py VT,结肠癌模型MCa38、CT26均为IC B治疗敏感型,而4T1和MCa P0008乳腺癌模型则为ICB治疗耐受型。(2)在对ICB敏感的肿瘤模型中,ICB治疗提高了肿瘤血管灌注功能和减少了组织缺氧面积,说明ICB治疗诱导了肿瘤血管正常化。而在对ICB耐受的肿瘤模型中,ICB治疗不影响肿瘤血管的功能。此外,CTLA4抗体治疗不影响正常组织血管的形态与功能。(3)免疫检查点抑制剂治疗不影响促血管生成因子的表达,但提高了具有抗肿瘤免疫反应和抑制血管形成双重功能的因子的表达,如IFN-γ和CXCL9。(4)流式细胞分析结果显示,ICB治疗提高了肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞的百分比。(5)在体内同时去除CD4+和CD8+T淋巴细胞,不仅消除了ICB的抑癌作用,而且逆转了其诱导的血管正常化;单独去除CD8+T淋巴细胞,而不是CD4+T淋巴细胞,可以逆转ICB治疗对肿瘤生长和血管的影响。这些结果表明ICB治疗通过CD8+T淋巴细胞来诱导肿瘤血管正常化。(6)胞内染色分析结果显示,CTLA4抗体治疗促进了IFN-γ在CD8+T淋巴细胞中的表达。(7)利用抗体中和IFN-γ,或者IFN-γ受体基因敲除,都可以消除CTLA4抗体治疗对肿瘤生长和血管的影响,说明IFN-γ信号通路是CTLA4抗体治疗诱导肿瘤血管正常化所必须的。(8)在对ICB敏感的肿瘤模型中,肿瘤血管灌注功能的增加程度与ICB的疗效呈正相关。所以,可以利用肿瘤血管功能状态的变化将肿瘤分为“有反应”组与“无反应”组。(9)通过比较分析CTLA4抗体治疗在不同时间点对肿瘤生长与肿瘤血管功能的影响,结果显示CTLA4抗体治疗对肿瘤血管功能的促进作用先于其对肿瘤生长的抑制作用。这说明肿瘤血管功能增强是CTLA4抗体治疗诱导的变化,而不是肿瘤大小改变带来的变化。(10)在EO771荷瘤小鼠接受CTLA4抗体治疗后的第6天(即给药2次后),利用多普勒超声和3D成像技术检测肿瘤血管的灌注功能,可以将肿瘤分为高灌注组与低灌注组。在结束CTLA4抗体治疗(即给药后第12天)后,高灌注组有90%的肿瘤表现出对CTLA4抗体治疗敏感,而低灌注组均抵抗CTLA4抗体治疗。这说明肿瘤血管功能变化可以作为一种无创伤的指标来预测免疫检查点抑制剂的疗效。【研究结论与意义】免疫检查点抑制剂可以通过激活CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ来诱导肿瘤血管正常化,其诱导的肿瘤血管正常化的程度与其疗效呈正相关。而且,免疫检查点抑制剂对肿瘤血管的促进作用先于其对肿瘤生长的抑制作用,所以,监测肿瘤血管功能变化可用于预测免疫检查点抑制剂的疗效。根据这些研究结果,我们提出了一个免疫检查点抑制剂的新的作用机理:免疫检查点抑制剂激活了CD8+T淋巴细胞,从而诱导了肿瘤血管正常化;肿瘤血管正常化可以重塑肿瘤微环境,减少免疫抑制性,进一步促进了CD8+T淋巴细胞的活化;这一正反馈过程的建立促进了活化的CD8+T淋巴细胞对癌细胞的清除作用。这一新机理可以较好地解释免疫检查点抑制剂的选择性疗效。而且,我们首次提出了肿瘤血管功能指标可作为一种标志物来评估和预测免疫检查点抑制剂的治疗效果。由于血管功能指标可以通过医学影像学手段来实时无创地获取,这为建立个体化肿瘤精准免疫治疗提供了一种全新的思路与方法。