论文部分内容阅读
研究背景:龋病和牙外伤是青少年的常见病和多发病,如果得不到及时而有效的治疗会导致牙髓坏死或根尖周病变,引起年轻恒牙牙齿发育停滞,相应地抗力减弱,严重影响患者的咀嚼功能和美观。根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)存在于发育中的恒牙根尖乳头组织,研究表明SCAP在牙根发育中发挥重要作用,因其与牙髓干细胞相比,有更强的增殖和分化潜能,成为牙髓牙本质再生重要的种子细胞。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,可与目标mRNA的3’端非编码区(3’untranslatedregion,3’UTR)结合,从而负向调控靶基因的表达,发挥转录后调控的作用。研究发现,miRNA对间充质干细胞的成骨向分化有重要的调控作用,且多数通过信号通路进行调控。而有关miRNA对于根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的调控机制尚不清楚。因此,本研究拟建立SCAP成骨/成牙本质分化相关的miRNAs表达谱,筛选并确定在SCAP成骨/成牙本质向分化中表达明显升高的miR-497-5p,探究miR-497-5p对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响以及相关机制。阐明miR-497-5p调控SCAP成骨/成牙本质向分化的作用和机制,为牙髓牙本质再生研究提供实验依据,为优化miRNA参与的牙源性干细胞组织再生相关的治疗奠定基础,为年轻恒牙根尖周病变提供新的治疗策略和思路。研究方法与结果:第一部分人根尖乳头干细胞的分离、培养和鉴定研究方法:采用酶消化法分离培养SCAP;利用CCK-8法检测SCAP连续10天的吸光度值并绘制生长曲线;结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力;流式细胞仪检测SCAP表面分子标记;成骨和成脂诱导培养SCAP,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色,进行多向分化能力检测。实验结果:原代培养7-10天,显微镜下可见有部分细胞呈团簇状贴壁生长,形态多为长梭形。CCK-8实验结果显示,SCAP的生长曲线整体呈“S”型,体现出明显的三个生长时期:潜伏期、对数生长期、平台期。结晶紫染色检测克隆形成率约为39%。流式细胞仪检测结果显示SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物STRO-1(31.8%)、CD24(23.2%)和CD146(99.5%),造血分子表面标记物 CD34(0.27%)和CD45(0.16%)则为阴性。成骨诱导7天,ALP染色显示胞浆呈明显的蓝紫色;成骨诱导21天,茜素红染色显示有大量的褐色矿化结节生成;成脂诱导28天,油红O染色显示胞质中有大小不一的红色脂滴形成。第二部分根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化前后差异性表达miRNAs的筛选和目标miRNA——miR-497-5p的确定砑究方法:由北京博奥晶典公司采用Affymetrix的miRNA4.0表达谱芯片筛选出SCAP成骨诱导前后差异表达的miRNA;利用qPCR技术验证芯片结果,并挑选稳定差异表达的miRNA;qPCR检测miR-497-5p在SCAP成骨分化过程中的表达时相。实验结果·:聚类分析结果显示,SCAP成骨诱导后共有64个miRNAs发生了改变(≥2.0倍),其中25个miRNAs上调,39个miRNAs下调。选择2个上调(hsa-miR-660-5p,hsa-miR-497-5p)和3个下调(hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-3651,hsa-miR-6511a-3p)的miRNA进行qPCR验证,与芯片结果一致。其中,在SCAP成骨/成牙本质向分化中表达明显升高的是miR-497-5p,miR-497-5p在诱导第3天表达量有所降低,但无统计学意义,之后自第7天表达量明显上调,持续至21天。第三部分miR-497-5p对根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的影响研究方法:利用细胞转染技术过表达/抑制表达miR-497-5p后,检测细胞ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平,并行ALP及茜素红染色。实验结果:过表达miR-497-5p,ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平均升高,ALP染色显示更深染的蓝紫色,茜素红染色显示矿化结节明显增多。以上表明SCAP的成骨24h后更换为成骨诱导液培养7天/成牙本质向分化能力得到了促进;反之,抑制miR-497-5p的表达后,SCAP的骨向/成牙本质向分化能力被抑制。第四部分miR-497-5p在根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化中的作用机制研究研究方法:利用生物信息学方法和双荧光素酶报告基因实验,确定miR-497-5p的直接靶基因为Smurf2;沉默Smurf2的表达后,检测细胞ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平,并行ALP及茜素红染色;分别过表达、抑制miR-497-5p表达以及沉默Smurf2的表达后,检测TGF-β/Smad通路相关蛋白表达情况;Western blot检测抑制内源性miR-497-5p并干扰Smurf2后成骨/成牙本质相关基因变化。实验结果:双荧光素酶报告基因实验显示,Smurf2是miR-497-5p的直接靶基因;沉默Smurf2后,SCAP的成骨/成牙本质向分化能力得到了促进;过表达miR-497-5p后TGF-β/Smad信号通路重要因子Smad2、Smad3、Smad4的表达量均有明显增加,而在抑制内源性miR-497-5p后,Smad2、Smad3、Smad4的表达量均有明显降低。在沉默Smurf2后,Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白水平表达量均有明显增加;抑制内源性miR-497-5p,同时干扰Smurf2,结果发现干扰Smurf2后,miR-497-5p inhibitor抑制SCAP成骨/成牙本质向分化的作用都受到阻碍。结论:1.首次发现miR-497-5p具有促进SCAP成骨/成牙本质向分化的作用;2.双荧光素酶报告基因实验证实Smurf2为miR-497-5p的直接靶基因;3.发现Smurf2能够抑制SCAP的骨向/成牙本质向分化;4.miR-497-5p通过Smurf2参与调控TGF-β/Smad通路,从而促进SCAP成骨/成牙本质向分化。