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禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种急性病毒性传染病，根据致病情况的不同可分为非致病性禽流感、低致病性禽流感和高致病性禽流感三种类型。其中低致病性禽流感H9N2亚型最早出现于上世纪60年代，自90年代末期鸡的H9N2禽流感病毒在世界各地开始大面积出现。通过对禽流感进行的血清学调查发现H9N2阳性鸡群在禽流感阳性鸡群中所占比例超过90%，证明此亚型是影响我国养禽业的主要AIV亚型。本研究通过制备抗H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体，旨在为禽流感疫情监测及诊断方法的建立提供技术基础。将H9N2禽流感病毒经尿囊腔接种9-11日龄的SPF鸡胚，37℃环境孵育。用蔗糖密度梯度离心法将收集的病毒尿囊液离心，沉淀用PBS溶解并于-70℃保存。将纯化好的病毒与等量的弗氏完全佐剂混合后乳化用于首次免疫，每只小鼠100μg。14d后使用经弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行第二次免疫，每只小鼠100μg。再次间隔14d后以与第二次免疫相同的剂量和方式进行第三次免疫，细胞融合前进行一次加强免疫。三次免疫之后选取抗体效价最高的小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合。融合后第7d用HAT培养液半量换液1次，第10d开始检测。将纯化好的H9N2禽流感病毒抗原、小鼠阴性血清分别进行倍比稀释，选择OD450值在1.0左右，且P/N值最大的抗原作为其最佳工作浓度。取8-11周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体石蜡，每只0.5mL。8d后将5×106个杂交瘤细胞从腹腔打入。采集腹水并离心以去除油脂沉淀。收集好的上清液用建立的ELISA方法检测腹水效价，保存于-70℃备用。将MDCK细胞铺至6孔细胞培养板做间接免疫荧光实验，凡有明亮绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。为了进一步鉴定2株杂交瘤细胞是否为抗H9N2禽流感病毒NP蛋白单抗，将重组真核表达质粒pCDNA-NP转染于MDCK细胞。阴性对照则使用经空质粒转染的细胞，转染24h后固定细胞进行IFA检测，在荧光显微镜下观察结果。凡有明亮绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。经过免疫与融合后使用有限稀释法对细胞株进行连续3次的亚克隆，共获得2株稳定分泌抗H9N2AIV抗体的杂交瘤细胞株，将其分别命名为1E7和3D6。将杂交瘤细胞的培养上清和腹水分别进行2倍系列稀释，结果1E7的腹水效价为1:25600，细胞上清效价为1:512。3D6的腹水效价为1:12800，细胞上清效价为1:256。用H9N2病毒感染MDCK细胞做IFA检测，结果显示2株杂交瘤细胞均可产生明亮绿色荧光，表明这2株杂交瘤细胞均可以与H9N2AIV的某些蛋白发生结合。使用经pCDNA-NP真核质粒转染的MDCK细胞做IFA检测，1E7和3D6出现了明亮绿色荧光。对照组未出现荧光。Western-Blot实验中2株单抗没有出现特异性条带。