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目的:观察及对比NK细胞、i NKT细胞及γδT细胞的体外扩增效率、表面标志表达及细胞因子分泌情况,并对比其对肿瘤细胞株的杀伤效果,为免疫细胞的临床抗肿瘤应用提供参考。方法:1.三种免疫细胞的扩增培养及功能检测采集健康供者的静脉血,使用Ficoll密度梯度离心获得PBMCs,检测细胞数量、CD56等表面标志表达情况及颗粒酶B等细胞因子分泌情况后,分别培养扩增3种免疫细胞。(1)NK细胞扩增培养用含5%血清、500U/ml IL-2、2ng/ml IL-15、1μg/ml OK432的RPMI-1640培养基培养24小时,后更换为含5%血清、1000U/ml IL-2、2ng/ml IL-15的RPMI-1640培养基继续培养,第14天获得NK细胞。(2)i NKT细胞扩增培养用含有10%血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基悬浮PBMCs,加入终浓度为100ng/ml的α-Gal Cer,置于37℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中培养,第4天和第7天补加终浓度为100ng/ml的α-Gal Cer和终浓度为20IU/ml的IL-2,之后每3-4天补充含有10%血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640及终浓度为20U/ml的IL-2,第14天获得i NKT细胞。(3)γδT细胞扩增培养用含有1μM唑来磷酸和400U/ml IL-2的完全培养基培养PBMCs,每2-3天补充含400U/ml IL-2的完全培养基,第14天收获γδT细胞。(4)功能检测体外培养14天后分别检测3种免疫细胞数量及纯度,用流式细胞分析仪检测各细胞表面标志的表达情况,用酶联免疫吸附试剂盒检测IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α分泌情况,用BD Cytofix/CytopermTM Kit manual胞内检测颗粒酶分泌情况,做Calcein释放实验检测3种免疫细胞对K562、Jurkat、Hep G2和A549这4种肿瘤细胞的杀伤效果。2.肿瘤细胞的培养用含有10%胎牛血清,100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基,于37℃、饱和湿度的5%CO?培养箱培养4种肿瘤细胞株,分别为K562(慢性髓系白血病细胞)、Jurkat(急性淋巴白血病细胞)、Hep G2(肝癌细胞)、A549(非小细胞肺癌细胞),每天观察细胞生长情况并进行换液。结果:1.经过体外扩增,NK细胞的数量由(34.80±4.19)×106个/ml增长至(2531.00±306.28)×106个/ml,i NKT细胞数量由(14.50±3.87)×106个/ml增长至(748.00±106.85)×106个/ml,γδT细胞数量由(31.60±2.88)×106个/ml增长至(1752.00±102.83)×106个/ml。2.体外扩增培养得到的NK细胞和γδT细胞的NKG2D表达均明显高于i NKT细胞(P<0.05),前两者之间差异无统计学意义(P=0.110)。扩增培养后的i NKT和γδT细胞的CD158a表达明显低于NK细胞(P<0.05),NK和γδT细胞的CD158b表达均明显低于i NKT细胞(P<0.05)。3.扩增培养得到的NK细胞的颗粒酶B和IFN-γ的分泌活性最强,i NKT细胞颗粒酶B的分泌活性较前两者弱,统计过程均P<0.05。4.对比每种免疫细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤效果。NK细胞在5:1的低效靶比时即对Hep G2表现出较高的杀伤活性(约59.5%),优于对其他肿瘤细胞株的杀伤活性(P<0.05)。当效靶比为20:1时,NK细胞对Hep G2和Jurkat细胞株的杀伤活性都高于90%。γδT细胞在5:1的低效靶比时即对Jurkat细胞株表现出较高的杀伤活性(约52.5%),明显优于对其他肿瘤细胞株的杀伤活性(P<0.05)。当效靶比为20:1时γδT细胞对Jurkat细胞株的杀伤活性高达92.5%。i NKT细胞在效靶比为5:1时对肿瘤细胞株的杀伤活性不高(均低于20%),其中对K562杀伤效率优于对其他肿瘤细胞株(P<0.05)。5.分别对比不同免疫细胞对每种肿瘤细胞株的杀伤效果,结果显示:对于A549,在5:1的低效靶比时,γδT细胞的杀伤效果优于NK细胞和i NKT细胞(P<0.05),杀伤效率为19.5%。当效靶比升高至20:1时,NK细胞的杀伤效果最好(P<0.05),约55%。对于Hep G2,NK细胞对其的杀伤在5:1的低效靶比条件下就已经明显优于i NKT和γδT细胞(P<0.05),并且在效靶比为20:1时NK细胞的杀伤效率更是超过了90%。对于Jurkat,当效靶比为5:1时,γδT细胞即表现出明显优于NK和i NKT细胞的杀伤能力(P<0.05),杀伤效率为52.5%,效靶比为20:1时,NK细胞和γδT细胞的杀伤效率均高于90%,两者之间无显著统计学差异(P<0.05)。对于K562,NK细胞在5:1的低效靶比条件下即表现出更优的杀伤效果(P<0.05),杀伤效率为51.5%。结论:1.体外扩增培养能够获得大量功能活跃的NK细胞、i NKT细胞和γδT细胞。2.体外扩增获得的NK细胞颗粒酶B和IFN-γ的分泌活性优于i NKT细胞和γδT细胞。3.体外扩增获得的i NKT细胞可以杀伤肿瘤细胞,但单独应用效果并不理想。对Hep G2、K562和A549,应用细胞免疫治疗的最优选是NK细胞,对于Jurkat的首选是γδT细胞;而同样应用NK细胞或i NKT细胞治疗,效果最佳的是Hep G2,同样应用γδT细胞治疗,效果最佳的是Jurkat。