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第一部分D-半乳糖诱导的SD大鼠拟老化模型的建立 目的:建立 D-半乳糖诱导的拟老化SD大鼠模型。 方法:90只4周龄的SD大鼠，随机分为两组, D-半乳糖组(拟老化组）：于颈背部皮下，注射500mg/kg/d D-半乳糖，连续8周；对照组：等体积0.9％的生理盐水，颈背部皮下注射，连续8周。造模结束后，D-半乳糖组和对照组按时间点各分为三个亚组：3月龄组（给药结束后0个月），9月龄组（给药结束后6个月）和15月龄组（给药结束后12个月）。给药结束后，检测大鼠听性脑干反应（Auditory Brainstem Response, ABR）；酶标仪检测总超氧化歧化酶（Total Superoxide Dismutase, T-SOD）和丙二醛（Malondialdehyde termimal，MDA）的水平；实时定量PCR检测听皮层线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)常见缺失突变（Common Deletion, CD）的水平；甲苯胺蓝染色法观察听皮层神经元细胞密度的变化；透射电镜观察听皮层神经元细胞超微结构的变化。 结果：ABR听力检测显示：在相同频率（4KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz），同龄D-半乳糖组和对照组相比，听力阈值未见显著性统计学差异（p>0.05）。对照组中，在8kHz、16kHz、24kHz、32kHz频率,15月龄较9月龄，3月龄大鼠听力阈值增高，差异具有统计学意义（P<0.05）。D-半乳糖组中，在4KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz频率，15月龄较9月龄、3月龄大鼠听力阈值增高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与同龄对照组相比，9月龄、15月龄D-半乳糖组大鼠T-SOD水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与同龄对照组相比，3月龄，9月龄，15月龄D-半乳糖组大鼠MDA水平增高，差异具有统计学意义（P<0.01）。D-半乳糖组mt DNA CD与同龄对照组相比升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。在对照组中，15月龄大鼠听皮层mtDNA CD比3月龄以及9月龄大鼠听皮层mt DNA CD缺失率升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。甲苯胺蓝染色法显示，15月龄D-半乳糖组较其他各年龄组神经元密度下降,差异具有统计学意义，(P<0.05)。透射电镜观察到D-半乳糖组大鼠比对照组大鼠出现衰老样超微结构病理变化如细胞核变形、染色质异常分布、线粒体肿胀、脂褐素聚集、神经纤维脱髓鞘样变等的时间更早，而且这些变化更显著。 结论：随年龄增长，听皮层抗氧化酶的活性下降，mtDNA CD蓄积增加，神经元密度降低，神经元细胞结构逐渐出现退行性变，而且D-半乳糖组较对照组这些变化出现的更早，更明显。长时程、高剂量的D-半乳糖会加速听皮层细胞的衰老。 第二部分 Sestrin2蛋白以及自噬在D-半乳糖诱导的拟老化大鼠听皮层中的作用及作用机制 目的:老年性聋是老年人最常见的感觉障碍疾病，它会导致老年人身体、认知、情绪、行为等一系列的功能障碍。目前老年性聋的发病机制还不清楚。本研究目的是探讨自噬，以及自噬相关调控通路蛋白Sestrin2，AMPK以及p70S6K蛋白在D-半乳糖拟老化大鼠听皮层中的作用。 方法：将120只4周龄的SD大鼠，随机分为两组给药：D-半乳糖组（拟老化组）：D-半乳糖500mg/kg/d，颈背部皮下注射，连续8周；对照组：等体积0.9%生理盐水，颈背部皮下注射，连续8周。给药结束后，D-半乳糖组和对照组按时间点各分为三个亚组：3月龄组（给药结束后0个月）,9月龄组（给药结束后6个月）和15月龄组（给药结束后12个月）。酶标仪检测总超氧化歧化酶（Total Superoxide Dismutase, T-SOD）和丙二醛（Malondialdehyde termimal，MDA）的水平；实时定量PCR检测听皮层线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)常见缺失突变（Common Deletion, CD）的水平。实时定量PCR法检测beclin1/Atg6, LC3B/Atg8, Sestrin2 mRNA的表达水平。Westrrn blotting法检测LC3B, Beclin1, Sestrin2, p-p70S6K, p70S6K, p-AMPK, AMPK的蛋白水平。免疫荧光检测LC3B在听皮层的定位表达。 结果：9月龄以及15月龄D-半乳糖组大鼠T-SOD水平较同龄对照组降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。3月龄，9月龄以及15月龄D-半乳糖组大鼠MDA水平比同龄对照组增高，差异具有统计学意义（P<0.01）。 D-半乳糖大鼠听皮层mt DNA CD与同龄对照组相比升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。对照组组内比较，15月龄大鼠听皮层mtDNA CD比3月龄以及9月龄大鼠听皮层mt DNA CD升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示，与同龄对照组相比，9月龄D-半乳糖组大鼠听皮层Atg6mRNA表达水平上升1.09倍, P<0.05；与同龄对照组相比，3月龄以及9月龄D-半乳糖组大鼠听皮层Atg8mRNA表达水平分别上升0.2和0.27倍, P<0.05；Sestrin2 mRNA表达水平分别上升0.33和0.52倍, P<0.05。15月龄时，与对照组相比，D-半乳糖组Atg6mRNA、Atg8mRNA、Sestrin2 mRNA表达水平分别下降0.76倍，0.33倍和0.83倍, P<0.05。对照组组内比较时，9月龄以及15月龄大鼠较3月龄大鼠听皮层Atg8mRNA表达水平分别上升0.29和0.21倍, P<0.05；Sestrin2 mRNA表达水平分别上升0.62和0.83倍, P<0.05。Western blotting结果显示：与同龄对照组相比，3月龄以及9月龄D-半乳糖组听皮层Beclin1蛋白水平分别升高0.34，0.52倍, P<0.05；LC3Ⅱ/β-actin比率分别升高0.71和1.21倍, P<0.05；Sestrin2蛋白水平分别升高1.03和0.27倍, P<0.05；p-AMPK/AMPK比率升高1.57和0.67倍, P<0.05, p-p70S6K/p70S6K比率下降1.86和1.21倍, P<0.05。15月龄时，与对照组相比，D-半乳糖组大鼠Beclin1蛋白水平下降0.31倍，LC3Ⅱ/β-actin下降0.80倍，Sestrin2蛋白水平下降0.37倍，p-AMPK/AMPK比率下降1.11倍, p-p70S6K/p70S6K比率升高1.89倍, P<0.05。在对照组中，9月龄、15月龄较3月龄大鼠LC3Ⅱ/β-actin比率升高0.61和0.37倍, P<0.05;Sestrin2蛋白水平升高0.58和0.58倍, P<0.05;p-AMPK/AMPK比率升高0.71和1.04倍, P<0.05；p-p70S6K/p70S6K比率下降1.63和1.62倍, P<0.05。 结论：在D-半乳糖诱导的拟老化SD大鼠年龄增长的过程中，自噬水平也在改变，Setrin2-AMPK-p70S6K可能参与年龄相关的自噬活动的调节。大鼠年轻时，即3月龄以及9月龄时,为了防止氧化应激水平增高以及mtDNA突变增多对细胞的损伤作用，自噬水平升高以维持细胞的稳态。而D-半乳糖大鼠更年长一些，即15月龄时出现与自然衰老机体相似的自噬活动表现，自噬水平明显下降。而同龄的对照组大鼠，自噬活性未见明显下降。