Cas14a1是迄今为止发现的CRISPR/Cas系统中最小的一种由g RNA引导的核酸内切酶,是目前CRISPR/Cas系统中发现的比较新的Cas酶,并且已经有研究者开展了其研究工作。与其他Cas酶相比,Cas14a1具有蛋白分子量小、组成简单、发挥切割作用后其附属活性即可被激活等优点,有望成为一种最有效、应用最广泛的基因编辑和病原微生物检测的工具。本论文主要对Cas14a1相关重组酶的设计、构建、诱导纯化及酶活性机制进行了探究;主要结果如下:(1)Cas14a1相关重组酶的设计与构建。本课题以Cas14a1蛋白和Helicase解旋酶为研究对象,进行了Helicase、Helicase-Cas14a1和Cas14a1-Helicase蛋白原核表达载体的构建、蛋白的重组表达和纯化出。通过对诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度三个方面对蛋白原核表达条件初步筛选和优化,有效提高了蛋白的诱导表达水平。同时,通过对纯化缓冲液和纯化条件的优化,有效分离了杂蛋白,最终纯化出相对单一条带的Helicase、Helicase-Cas14a1和Cas14a1-Helicase蛋白,且蛋白纯度达到90%。(2)Cas14a1相关重组酶在体外基因编辑技术中初步应用。本课题对Helicase-Cas14a1和Cas14a1-Helicase这两种重组蛋白的酶活性机制及其应用进行了探究,其中主要进行了PCR扩增、荧光探针等分子生物实验。首先通过体外转录技术获得g RNA序列,然后g RNA引导重组蛋白对靶DNA进行识别,激活其蛋白活性来切割靶DNA。核酸PAGE凝胶检测和荧光探针技术实验结果表明,无论是否存在g RNA,只要反应时间达到40 min,Helicase-Cas14a1蛋白都能切割靶DNA,对靶DNA链的切割具有一定的非特异性;通过一系列的对照实验排除了Helicase、g RNA等因素的影响后,Cas14a1-Helicase蛋白并没有表现出明显的切割特性。此实验结果展现的蛋白切割特性,可能是两种蛋白结构域进行重组后,表现的一种非特异性的活性,其切割机制有待深入研究,为后续多功能蛋白的研究奠定实验基础。