骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）是一组获得性造血干细胞克隆性疾病，根据临床预后分为低危MDS（难治性贫血／难治性贫血伴环铁粒幼红细胞增多，RA／RAS）和高危MDS（难治性贫血伴原始细胞增多／转变中的RAEB，RAEB／RAEB-t）。近年来，国内外研究报道，抑癌基因p151NK4B启动子甲基化导致其功能失活与MDS的疾病进展有关。p15INK4B蛋白质是细胞周期依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）₄和CDK₆的抑制剂，通过抑制它们的丝氨酸／苏氨酸激酶效应，阻断分裂细胞由G₁期向S期过渡，从而抑制细胞增殖。p151NK4B基因启动子及转录起始区域内的CpG岛高度甲基化是导致该基因失活的重要方式。基因甲基化由DNA C5胞嘧啶甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）催化，DNMTs以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上。DNMTs在调节基因甲基化中起重要作用，迄今发现的人类DNA C5胞嘧啶甲基转移酶有三种，DMNT₁、DNMT_3A和DNMT_3B。国外有少数报道，急性髓细胞性白血病（AML）患者p151NK4B基因高度甲基化与DNMTs表达异常增高有关，DNMTs活性异常增高导致抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化可能是AML发病机制之一，但在MDS细胞中DNMTs表达状况，迄今未见报道。 三氧化二砷（AS₂O₃）系我国民间验方癌灵1号的主要成分。我国学者临床观察发现， 浙江大学博士学位论文 静脉滴注防；0可有效地治疗急性早幼粒细胞性白血病（SCllte promyelOCytiC leUk6mi。， APL），尤其是治疗复发和耐药的 APL患者。体外研究表明，AS203对某些肿瘤细胞具有诱导 调亡和分化、下调端粒酶活性、抗血管新生等作用。由于AS。03代谢过程中需要通过甲基化 被解毒，且甲基的来源是S一腺苦甲硫氨酸，使其有可能竞争甲基来干扰基因组DNA甲基化 模式。国外已有报道，AS。03可改变P53基因甲基化模式，国内仅见一篇报道，AS。0。可使人 急性淋巴细胞白血病系M。it4细胞P15INK4B基因去甲基化。但该方面的研究甚少。 有关AS。0。对hos的作用及其机理，国内外尚未见文献报道。本课题试图研究p15INK4B 基因甲基化模式改变与MDS发病的关系，及其可能的机制；阐明AS；0。治疗皿DS可能的作用 机理，为该药的临床应用提供实验和理论依据，为设计新的抗肿瘤策略拓宽思路。 本课题采用甲基化特异nR（methylation－speCific PCR，MSP）、RT－PCR和Western杂 交等方法研究了20例MDS患者，其中低危组10例，高危组10例。20例AL患者为阳性对 照组，其中急性髓细胞性白血病（AML）10例，急性淋巴细胞性白血病（ALL）10例。10 名正常骨髓志愿捐献者为阴性对照组。结果显示，正常对照组骨髓单个核细胞（MNCS）几 乎表达P15INK4B基因（90％，9／10）和P15INK4B蛋白质（90％，9／10），且均未检测到P15INK4B 基因甲基化。MDS患者骨髓MNCs s15INK4B基因 mRNA水平和蛋白质水平表达降低与 P15INK4B基因高度甲基化相关，表明MDS患者P15INK4B基因主要通过甲基化方式失活。 MDS低危组较正常组仅DNMT；表达增高，提示低危组骨髓单个核细胞P15INK4B基因甲基化 可能与DWT；高表达有关。高危组骨髓单个核细胞P15INK4B基因甲基化阳性率明显高于低 危组（60％ VS 10％），并伴有DNMT。＾、DNMT。mRNA表达异常增高。DNMT；在MDS低危组、高 危组患者均明显地增高，两组差异无统计学意义，表明，重新甲基转移酶DNMT。＾和DNMT。。mRNA 表达增高可能与血S高危有关。对照M组骨髓MNCS也有P15INK4B基因甲基化（45％，9／20） 和三种甲基转移酶 mRNA表达异常增高。与之比较，MI)S高危组患者骨髓 MNCs DNMT；、DNMT。B mRNA表达差异无显著性，而DNMT。＾mRNA表达低于AL组。上述结果表明hos患者骨髓MNCs 甲基转移酶异常高度表达可能与MDS向AL演进有关。国内外未见类似文献报道。 本课题以人MDS－RAEB细胞株MUTZI细胞为主要研究对象，应用MTT比色法观察了 AS。0。对 MUTZ－l细胞及对照组 HL－60细胞、Raj i细胞的生长抑制作用。结果显示，AS众对 2 浙江大学博士学位论文一以上细胞都有不同程度的生长抑制作用，其对MUTZl细胞的抑制作用明显地高于HL乃0细胞，而明显的低于 R幻i细胞。AS0。对 MUTZ＊细胞、HL乃0细胞与 R幻i细胞作用 24h的半数抑制浓度（IC。）值分别为 14．94umol／L、21．06umol／L和4．48umol／L。AS。0。对MUTZ－l细胞的生长抑制作用具有时间、剂量依赖关系。AS。0。处理MUTZ－1细胞24h、48h、72h的IC。值分别为 14．94 u mol