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苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）是一种能够抑制细菌和真菌的有机酸，即具有抑菌谱广的特点。PLA作为是一种新型生物防腐剂，有多种微生物能够生产PLA，尤其是乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）。LAB是公认为安全的微生物，有关LAB产PLA的报道很多，尤其是其中的杆菌属LAB，但是目前对于片球菌属LAB产PLA的报道很少，本文首次研究了乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，P. ac）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，P. pe）产PLA的能力，当P. ac和P. pe在MRS培养基上30oC培养36h后PLA分别达到0.65和0.27mmol/L。此外，探究了P. ac产PLA机理，当培养基中添加对应氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）以及酮酸（苯丙酮酸和羟基苯丙酮酸）前体时，PLA和P. ac所产的另一种抑菌物质羟基苯乳酸（OH-4-PLA）产量都得到了极大提高，但是这两种2-羟基酸都会受到非对应前体的抑制。随着对应和非对应前体添加量增加，促进和抑制作用都会增强，其中酮酸促进对应2-羟基酸产物的作用强于氨基酸，研究表明其原因是由于酮酸是对应2-羟基酸的最直接底物缘故；而氨基酸抑制非对应2-羟基酸作用强于酮酸，其原因是由于P. ac和P. pe发酵产PLA过程中氨基酸竞争共同的酶（氨基转移酶）的底物结合位点，进而抑制后续反应的进行，最终导致PLA合成受限制。乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，D-LDH）是LAB中转化底物苯丙酮酸（Phenypyruvate，PPA）生成PLA的主要酶。将P. ac和P. pe中可能存在的D-型乳酸脱氢酶（D-1actate dehydrogenase，D-LDH）基因克隆到质粒pET-22b（+）中，并将重组质粒转化到E. coli BL21（DE3）中，通过诱导表达并纯化出两个重组D-LDH，分别为PaLDH和PpLDH。通过对PaLDH酶学性质研究表明PaLDH在30°C pH5.5时酶活最大，以PPA和丙酮酸（Pyruvic acid，PA）为底物时酶活分别为140和422.1U/mg，米氏常数Km为2.92mmol/L，转化常数kcat为305s-1，催化常数kcat/Km为105（mmol/L）-1s-1。PpLDH酶学性质研究显示其在45°C pH5.5时酶活最大，动力学参数分别为Km1.73mmol/L、kcat173s-1和kcat/Km100（mmol/L）-1s-1。此外，Ogataea parapolymorpha DL-1中甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase，OpFDH）酶基因克隆并转化到E. coli中，酶学性质研究表明其最适pH在6.0–7.0范围，最适温度为65°C，40、50、55和60°C条件下保温4h后酶活分别保持93%、88%、83%和71%，说明OpFDH具有较高的热稳定性，动力学参数分别为Km5.98mmol/L、kcat15.6s-1和kcat/Km2.6（mmol/L）-1s-1。由于OpFDH最适pH范围较宽、热稳定性较高和对有机试剂耐受性强的特点可与LDH联合构建NADH辅酶再生体系，从而提高PLA产量，优化双酶合成PLA的反应条件后的最适温度为50oC，最适pH为6.0，LDH和FDH最适添加量都为0.4μmol/L，即体系中LDH和FDH浓度比例为1:1，此时PLA的产量达到5.5mmol/L。