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背景据中山大学相关统计分析研究,目前我国女性卵巢癌发病率高达6.1／10万,约占卵巢肿瘤总数的5%。虽然我国卵巢癌发病率低于欧洲、北美等发达国家,但据统计分析目前我国香港、广州和上海等沿海大城市发病率明显高于内地中心城市,而且生活富足地区的女性发病率明显增高,可能与饮食中高脂肪高蛋白摄取有关,尤其是食物中动物脂肪含量高有关。因此近年来,我们与发达国家间卵巢癌的发病率差距逐渐减小。卵巢癌中卵巢原发性癌的比例约占90%-95%,另外5%-10%为其他部位原发的癌转移至卵巢。由于卵巢癌早期临床症状少且不典型,缺乏特异性,同时门诊筛查有限,导致其早期诊断较困难,约70%左右的患者就诊时已为晚期。因此,虽然卵巢癌的发病率仅位于妇科恶性肿瘤第三位,低于宫颈癌和子宫内膜癌,但其死亡率却超过宫颈癌和子宫内膜癌之和,高居妇科癌症首位,严重威胁妇女健康。所以,早期发现是卵巢癌治疗的关键。探索卵巢癌早期敏感标志物,同时利用生物学治疗是目前卵巢癌研究的热点。卵巢癌的发生包括多基因、多阶段相互作用的复杂过程。癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤生长的决定因素。ARHI基因是近年来发现的抑癌基因之一,其在正常乳腺、卵巢、胰腺组织中均高表达。我们2006年前期试验结果表明在卵巢肿瘤中ARHI基因表达下调,在卵巢癌中缺失率高达67%。国内外相关研究也表明ARHI参与了胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌的发生发展。目前对于晚期卵巢癌的治疗,手术往往达不到满意效果,甚至无法行手术治疗,需依赖辅助化疗。随着化疗药物广泛应用,卵巢癌的耐药严重影响疗效。因此逆转卵巢癌耐药是目前研究热点。目的建立ARHI基因转染稳定表达的卵巢癌耐药细胞株A2780／DDP,观察转染前后ARHI基因的表达；探讨ARHI基因转染对裸鼠A2780/DDP移植瘤的生长抑制作用,研究顺铂对裸鼠荷瘤生长的影响；探讨ARHI基因转染对A2780细胞周期及侵袭转移能力的影响。第一部分ARHI基因在A2780细胞中的表达及意义方法：常规培养人上皮性卵巢癌细胞系A2780及A2780/DDP,应用RT-PCR和Western blot方法测定ARHI在两种细胞系内的基因和蛋白表达。构建ARHI基因的真核表达质粒pEGFP-Cl-ARHI,以脂质体介导法转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780、A2780/DDP,同时转染空载体pEGFP-C1质粒,以未转染细胞为对照；转染后细胞株分别命名为ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP, pEGFP-Cl/A2780和pEGFP-Cl/A2780/DDP。应用RT-PCR、Western blot方法分析ARHI基因及其蛋白表达。应用T检验A2780及A2780／DDP两种细胞中ARHI基因差别。应用秩和检验对比研究A2780及A2780/DDP转染前后目的基因的差别,同时横向对比转染后ARHI/A2780组、ARHI/A2780/DDP组目的基因的差别。所有结果均以P小于0.05作为临界值。结果：1、ARHI基因在A2780和A2780/DDP细胞株中表达应用RT-PCR及Western blot分别检测ARHI基因在A2780及A2780/DDP中mRNA及蛋白表达,结果显示ARHI存在低表达和缺失。RT-PCR检测A2780细胞株可发现ARHI弱表达,平均表达水平为0.027±0.01,A2780/DDP表达缺失。Wsestern blot检测A2780组蛋白表达,A2780/DDP组无蛋白表达。应用配对T检验检测转染前后A2780、A2780/DDP细胞ARHI基因mRNA及蛋白表达,两组差异具有显著性(p<0.05)。2、ARHI基因在ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP细胞株中表达ARHI基因转染稳定表达的A2780,A2780/DDP细胞株,利用RT-PCR及Western blot检测ARHI基因mRNA及蛋白表达,结果显示：ARHI/A2780组.ARHI/A2780/DDP组ARHImRNA表达均为阳性,平均表达水平分别为0.086±0.01,0.081±0.01；A2780空质粒转染组也可检测到ARHI基因mRNA表达,表达水平为0.029±0.01。A2780/DDP空质粒转染组无ARHI基因及蛋白表达。对比转染稳定ARHI/A2780及ARHI/A2780/DDP细胞株,两者转染后差异无显著性(P>0.05)。结论：1、ARHI基因在A2780、A2780／DDP细胞中低表达或缺失,ARHI基因与卵巢癌细胞耐药有关。2、利用脂质体介导ARHI质粒转染真核细胞,可得到稳定表达的细胞克隆,转染成功后可提高目的基因的表达。第二部分ARHI基因对裸鼠A2780/DDP移植瘤生长抑制作用的研究方法：稳定转染的ARHI/A2780/DDP组,PEGFP-Cl/A2780/DDP组和A2780/DDP组三组细胞系,在裸鼠右前肢根部皮下(腋窝)注射种植；观察ARHI对A2780/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影响。利用western blot方法检测裸鼠移植瘤体内ARHI表达。应用顺铂小剂量单药化疗干预各组瘤细胞种植裸鼠,顺铂作用途径分两组腹腔注射、尾静脉注射。观察顺铂对裸鼠移植瘤体生长的影响。结果：1、ARHI基因对A2780/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影响ARHI/A2780/DDP组、pEGFP-Cl/A2780/DDP组和A2780/DDP组细胞传代,于裸鼠腋窝皮下注射。接种10-12天后观察PEGFP-Cl/A2780/DDP (n=8)组和A2780/DDP (n=8)组所有裸鼠均成瘤,成瘤率达100%,瘤体体积在100mm3左右,观察瘤体生长速度较快。ARHI/A2780/DDP (n=8)组接种后,12天内仅1只裸鼠腋下有瘤体生成,但瘤体体积在30mm3,30天左右仅有3只裸鼠瘤体生成,早期瘤体增大至50mm3,后期两瘤体体积很小,肉眼观察较困难。2. ARHI基因在A2780／DDP裸鼠移植瘤内的表达裸鼠移植瘤体成瘤稳定后5-7天,处置各组裸鼠,应用western blot检测各组瘤体内ARHI差异,结果显示:ARHI/A2780/DDP组瘤体可见明显ARHI表达,pEGFP-Cl/A2780/DDP组和A2780/DDP组ARHI氐表达或缺失。秩和检验发现ARHI/A2780/DDP组与空载体转染组及未转染组相比差异有统计学意义(p<0.05)。pEGFP-C1/A2780/DDP组和A2780/DDP组之间无明显差别。3、ARHI基因转染联合顺铂对裸鼠移植瘤生长影响分别应用顺铂腹腔注射和尾静脉注射两种方法作用于三组裸鼠,观察7天,处置裸鼠,解剖裸鼠腋窝及腹腔。结果显示：顺铂作用后瘤体生长速度明显减慢。ARHI/A2780/DDP组、pEGFP-C1/A2780/DDP组和A2780/DDP组瘤体均有不同程度的变性坏死,瘤体体积及重量较基础体积及重量降低。ARHI/A2780/DDP组与其余两组间差异显著(p<0.05)。三组裸鼠处死后均未见明显腹腔转移,无明显腹水形成。腹腔注射组与尾静脉注射组两者之间无显著差异(p>0.05)。结论：1、ARHI基因稳定转染可以抑制裸鼠体内A2780/DDP移植瘤的形成及生长。2、ARHI基因转染联合顺铂治疗可明显抑制A2780/DDP移植瘤的生长。第三部分ARHI基因对A2780/DDP细胞周期和侵袭能力的影响方法：转染稳定的三组细胞系ARHI/A2780/DDP,pEGFP-Cl/A2780/DDP和A2780/DDP,稳定传代,分别针对细胞生长及侵袭机制进行如下研究：流式细胞仪PI染色方法检测ARHI基因和空载体转染对卵巢癌细胞株细胞周期的影响。应用MTT(?)生长曲线分析ARHI基因对卵巢癌细胞增殖的影响。流式细胞仪PI染色检测ARHI基因对卵巢癌细胞凋亡的影响。应用细胞划痕试验检测ARHI基因对卵巢癌细胞迁移的影响。应用Wwstern blot方法检测ARHI基因对PI3K/AKT信号转导通路和死亡相关蛋白激酶1(DAPKl)的影响。结果：1、ARHI基因对A2780/DDP细胞周期的影响应用流式细胞仪PI染色方法检测ARHI/A2780/DDP组、pEGFP-Cl/A2780/DDP组和A2780/DDP组细胞周期的变化,结果显示：停滞于G1期细胞由A2780/DDP的51%, pEGFP-C1/A2780/DDP的55%上升至ARHI组的69%。统计学分析ARHI组与空载体及未转染两组比较差异显著(p＜0.05),A2780/DDP组、pEGFP-C1/A2780/DDP组之间无显著差异(p>0.05)。2、ARHI基因对A2780/DDP细胞增殖的影响应用MTT检测ARHI/A2780/DDP、pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP三组细胞细胞增殖能力,结果显示：在第5天时检测A2780／DDP组及空载体组细胞较第一天增长5-6倍,ARHI组仅增长3倍左右。统计学分析ARHI组与其余两组差异显著。A2780/DDP组,空载体组无明显差异。3、ARHI基因对A2780/DDP细胞凋亡的影响应用流式细胞仪PI染色检测A2780/DDP细胞转染前后凋亡率,结果显示：细胞凋亡率在A2780/DDP组、空载体组分别为11.1%、11.7%,ARHI组为29.9%。ARHI转染显著增加肿瘤细胞凋亡率(p<0.05)。4、ARHI基因对A2780/DDP细胞迁移的影响应用细胞划痕试验检测A2780/DDP细胞转染前后迁移能力,结果显示：细胞迁移率在A2780/DDP组,空载体组无显著差异,但ARHI组细胞迁移率显著减慢(p<0.05)。5、ARHI基因对A2780/DDP细胞PI3K/AKT信号转导通路和死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)的影响应用western blot方法检测三组细胞株中磷酸化AKT的表达,结果证实ARHI组P-AKT蛋白表达下调。在ARHI转染组中DAPK1蛋白表达比A2780/DDP组、空载体组上调。统计学分析ARHI转染组与其余两组差别具有显著意义。结论；1、ARHI基因使A2780/DDP细胞停滞于G1期,抑制细胞增殖,增强细胞凋亡,减缓细胞的侵袭性。2、ARHI基因通过增加P-AKT蛋白及DAPK1蛋白表达,阻断PI3K/AKT信号传导通路,抑制A2780/DDP细胞生长。创新点1、ARHI基因在顺铂敏感性细胞株A2780及耐药性A2780／DDP细胞中表达有显著差异。2、ARHI基因过表达可明显抑制A2780/DDP裸鼠移植瘤的生长。3、ARHI基因过表达可通过阻断PI3K/AKT信号传导通路,抑制A2780/DDP细胞增殖及侵袭能力。