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研究背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的85%,NSCLC主要包括肺腺癌(LUAD)和鳞状细胞癌(SCC)。在NSCLC病例中,LUAD患者约占60%,复发率高且5年总生存率很低是引起肺腺癌死亡率高的主要原因。因此,筛选关键作用因子并阐明其在LUAD发展中的作用机制,对LUAD防治至关重要。支链氨基酸转氨酶1(BCAT1)与人类多种恶性肿瘤相关,研究表明BCAT1在胃癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤组织中高表达,并且BCAT1的高表达与多种癌症的预后不良、肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭密切相关。我们对临床LUAD样本检测发现BCAT1在癌组织中高表达,表明BCAT1很可能参与了 LUAD的发展,因此,本项目拟研究BCAT1在LUAD发展中的作用机制,为临床LUAD诊断与治疗提供实验依据。研究目的本研究旨在阐明体外条件下BCAT1对肺腺癌发展的影响及其作用机制。研究方法1.在包含由93个人类LUAD组织和85个癌旁组织组成的组织芯片中,用免疫组化的方法检测肺腺癌癌组织及癌旁组织中BCAT1的蛋白表达水平,染色结果按强度和阳性率进行评级,强度评分和阳性率评分的乘积可以代表BCAT1的蛋白表达水平。2.慢病毒先转染A549细胞,然后用嘌呤霉素筛选出来阳性克隆,来构建慢病毒稳定过表达和敲低BCAT1的肺腺癌细胞株。收集细胞提取RNA和蛋白,用qPCR和蛋白免疫印迹方法检测过表达和敲低效果。3.用实时无标记细胞功能分析仪每5min测量一次细胞阻抗(取决于附着细胞的数量和形状),持续70小时,以监测细胞的增殖情况。用克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,用划痕修复、Transwell实验方法检测BCAT1对A549细胞的迁移能力以及侵袭能力的影响。4.利用转录组测序的方法寻找BCAT1过表达细胞和对照细胞之间的差异表达基因,并通过生物信息学分析改变的信号通路和生物学功能。5.使用seahorse XF-96细胞生物能分析仪进行糖酵解和线粒体压力测试,测量实时细胞外酸化速率(ECAR)评估糖酵解水平和测量细胞耗氧率(OCR)评估线粒体有氧呼吸的变化。6.收集细胞,用游离脂肪酸测定试剂盒检测细胞中游离脂肪酸含量,qPCR和蛋白免疫印迹的方法检测脂质代谢及谷氨酰胺代谢相关基因的表达水平。研究结果1.BCAT1在临床肺腺癌组织中的表达量明显高于癌旁组织。2.BCAT1过表达显著增强LUAD细胞的增殖速度与克隆形成能力,使划痕愈合速度加快、迁移与侵袭细胞数量增加。BCAT1敲低抑制LUAD细胞增殖、克隆形成、划痕愈合、迁移与侵袭能力。3.BCAT1过表达与对照组LUAD细胞转录组学检测共鉴定到155个差异表达的基因,与对照组细胞相比,过表达组细胞中96个基因表达上调,59个基因表达下调,差异表达的基因涉及碳水化合物、脂类与氨基酸代谢等能量代谢通路。4.BCAT1过表达显著抑制LUAD细胞线粒体有氧呼吸,相关代谢酶如:丙酮酸脱氢酶(PDH)、柠檬酸合酶(CS)、细胞色素c、电压依赖性阴离子通道(VDAC)和琥珀酸脱氢酶(SDHA)等表达水平显著降低。BCAT1过表达对LUAD细胞的糖酵解水平没有显著影响,两种关键糖酵解酶己糖激酶2(HK2)和乳酸脱氢酶A(LDHA)的蛋白表达水平也没有显著变化。5.BCAT1过表达主要影响LUAD细胞中脂质合成与分化,与之相关的基因长五聚蛋白3(PTX3)、含阻遏蛋白结构域蛋白4(ARRDC4)和肝癌缺失基因1(DLC1)转录水平升高,对脂肪酸分解影响不大。6.BCAT1过表达促进LUAD细胞谷氨酰胺分解代谢,细胞中谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酸脱氢酶(GLUD1)蛋白表达水平升高,谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达显著减少。结论1.BCAT1在肺腺癌组织中高表达并促进LUAD细胞的增殖、迁移、侵袭。2.BCAT1过表达通过抑制线粒体有氧呼吸、加快谷氨酰胺代谢和脂质合成分化等促进LUAD细胞代谢重编程。