本文分为两部分论述了人逼尿肌细胞肾上腺素能β<,3>受体基因亚型细胞的培养及干预性实验。 第一部分：为进一步探讨β-AR亚型在逼尿肌中的功能奠定基础，拟采用反义基因(antisense)技术，构建β-AR亚型的RNA干涉质粒体，封闭三种β-AR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定β-AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据。 研究材料与方法： 一、脂质体转染逼尿肌细胞。 (一)实验材料：293H、细胞购自．Invitrogen公司；DMEM培养基；100mg/L氨苄青霉素、50mg/L链霉素；10％胎牛血清(四季青公司)；PBS(磷酸盐缓冲溶液)；胰酶/EDTA消化液：Lipofecter脂质体转染试剂；β<,1>-PGS质粒和β<,3>-PGs质粒。 (二)实验器材：20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头；酒精灯；废液缸；涡旋振荡器；恒温水浴箱；台式离心机；35mm培养皿；转染管；15ml离心管；观察用倒置显微镜。 (三)实验步骤： 1、细胞传代。 2、细胞转染： 二、正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞的β-AR受体表达鉴定。 (一)RT-PCR。 1、主要试剂：RNA提取试剂TRIzol Reagent公司产品；总RNA分离试剂为GIBCOBRL公司产品；逆转录试剂SuPERSCREPTTM Preamplification System Kit为GIBCOBRL公司产品；Dnasei GIBCOBRL公司产品；PCR试剂TaKaRa公司产品；RNA LAPCRKit(AMV)为TaKaRa公司产品；JMl09大肠杆菌感受态菌株购于Takara公司。 2、主要仪器设备。超纯水装置-美国MILLIPORE MILLI-Q；实验室制冰机-德国ZIGERA 2BE．70-35；振荡水浴箱-美国GFL THERMOLAB；超低温冰箱-日本SANYO MDF-U4086S；鼓风干燥箱-中国余姚TDW；旋涡振荡器-美国 VORTEX-2 GENE； (二)免疫蛋白印迹杂交(Western blot)。 1、主要试剂。 (1)鼠单克隆抗体p27(Santa Cruze公司)。 (2)ECL试剂盒(Santa Cruze公司)。 (3)辣根过氧化酶标记羊抗鼠二抗。 2、主要仪器。超声波细胞破碎仪-德国Dr．hielscher GmbH UP 50H紫外透射仪-英国UVItec STX-20M电动匀浆器-德国Heidolph DIAX 900真空冷冻干燥机一德国CHRIST ALPHAI-4半干转印仪-美国Bio-Rad公司Seimidry transfer system水平摇床-美国GFL自动封膜仪Shandon Citadil 2000组织脱水机-美国。 实验结果 1、RT-PCR鉴定脂质体转染逼尿肌细胞结果电泳结果显示：与空载体转染的逼尿肌及未被转染的正常传代的逼尿肌细胞相比，β<,1>-AR和β<,2>-AR干涉分子转染逼尿肌细胞中β<,1>-AR，β<,2>-ARmRNA表达显著减少，β-actin mRNA表达无显著差异，说明RNAi对β<,1>-AR、β<,3>-AR mRNA表达抑制是特异性的。光密度扫描结果显示pGC-β<,1>-ARi转染细胞与空细胞相比β<,1>-ARmRNA表达抑制率可达77％，pGC-β<,3>-ARi转染细胞与空细胞相比β<,2>-ARmRNA表达抑制率可达79％。 2、蛋白电泳鉴定脂质体转染逼尿肌细胞的结果通过Westem印迹检测了β-AR蛋白表达的变化，蛋白电泳结果显示：与阴性对照空载体转染的逼尿肌及未被转染的正常传代的逼尿肌细胞相比，β1-AR和β<,2>-AR干涉分子转染的细胞中蛋白表达水平显著下降，而两者的β-actin蛋白表达无显著差异，说明RNAi抑制β-AR蛋白的表达是特异性的。光密度扫描结果显pGC-β1-ARi和pGC-β<,2>-ARi的抑制率分别为83％和87％。 研究结论： 成功地完成了肾上腺素能β-AR单一基因亚型的细胞系的建立，这就为以后的实验奠定了实验基础。 第二部分：观察了非选择性β-AR激动剂异丙肾上腺素分别对于三种β-肾上腺素能受体单一基因亚型的逼尿肌细胞的作用结果，我们以期通过测定细胞内cAMP水平的变化来评价β-肾上腺素能受体亚型的功能。 研究材料与方法： 一、实验材料。 1、DMEM培养基；100mg/L氨苄青霉素、50mg/L链霉素；10％胎牛血清(四季青公司)；PBS(磷酸盐缓冲溶液)；胰酶/EDTA消化液； 2、cAMP放射免疫试剂盒购于北京环亚泰克生物医学技术有限公司。 3、异丙肾上腺素(10<-6>mol/L)购于Sigma公司试剂配制：使用时，各种试剂都用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(TE)配制。 二、主要仪器设备。 1、离心机．美国GFL THERMOLAB。 2、水浴箱．美国MILLIPORE MILLI-Q。 3、SN-682放射免疫γ计数器．日本SANYO MDF-U4086S。 4、超低温冰箱-德国Dr．hIelscher GmbH UP 50H。 三、实验方法。 1、将原代培养的膀胱逼尿肌细胞，空载体转染的逼尿肌细胞和经过鉴定的β肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆分别加入100μl异丙肾上腺素(4个浓度组-10<7>、10<-8>、10<-9>、10<-10>mol/L)。 2、用超声细胞破碎仪破碎细胞(30s×5次)，12000r/min 4℃离心10 min，然后分别吸取上清液留用。 3、cAMP的测定按cAMP放射免疫试剂盒说明书进行 实验结果： 细胞内cAMP水平在异丙肾上腺素(10<-10>～10<-7>mol/L)作用下呈剂量依赖性升高，当异丙肾上腺素(ISO)浓度超过10<-8>mol/L时，可见明显升高cAMP的效应，最大作用见于10<-7>mol/L。β<,1>、β<,2>、β<,3>三种基因亚型的逼尿肌细胞产生了不同的cAMP水平，而且在ISO各个浓度(10<-1>、10<-8>、10<-9>、10<-10>mol/L)以β<,3>-受体亚型的逼尿肌细胞产生的cAMP水平最高。表2，IsoR寸不同类型逼尿肌细胞刺激的cAMP产生量(单位pmol/ml)讨论膀胱过度活动症是一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁。 本研究分别采用反义基因技术，得到含有一种β-AR表达的逼尿肌细胞，然后用非选择性β-AR激动剂异丙肾上腺素处理细胞以消除激动剂亲和性和效能差异造成的影响，采用放射免疫检测法测定，确定β-AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，及其信号途径和调节机制。 从本实验中可以看到细胞内cAMP水平呈异丙肾上腺素剂量依赖性升高，而且通过反义技术得到的β<,1>β<,2>β<,3>三种基因亚型细胞的cAMP水平同样呈Iso剂量依赖性增长，而且可以看到以β<,3>一受体亚型的逼尿肌细胞产生的cAMP水平最高，从而可以说明β<,3>受体亚型在介导逼尿肌的松弛过程中起着更为主要的作用，而其它两种受体则起着从属的作用，当然cAMP增加水平仅是判断各受体功能的指标之一，此外还包括Ac活性和细胞膜电流和电位等等其他一些方面，需要我们进一步试验去证明，为阐明β受体在膀胱逼尿肌活动亢进中可能发挥的作用，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据。 研究结论： β<,3>受体亚型在介导逼尿肌的松弛过程中起着更为主要的作用，而其它两种受体则起着从属的作用，这就为膀胱功能障碍的药物治疗提供了理论基础。