研究背景肝细胞癌(HCC)是严重威胁人类健康的疾病之一,是目前世界第二大致死性癌症,全球每年新增肝癌患者约有75万,且发病率也一直呈上升趋势。临床发现由HBV或HCV病毒感染所致的慢性肝炎、过量饮酒引发的酒精性肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎引起的慢性肝疾病等,是HCC产生的主要风险因素。由于肝细胞癌的发病机制极其复杂并具有异质性,对临床有效治疗造成困难。目前临床针对HCC的治疗的手段主要包括肝脏组织局部消融、肝脏切除、肝移植,或使用化疗、放疗药物对门静脉浸润或肝外扩散的患者进行全身性治疗。但以治疗手段既乏特异性,也不具有靶向性,还会造成患者机体正常组织细胞功能受到严重损伤,使患者的免疫系统遭到破坏,抑制机体启动抗肿瘤免疫应答。因此,选择更为有效且毒副作用较小的治疗手段,是HCC免疫治疗的主要研究目标。近年来,利用机体免疫细胞对HCC进行细胞免疫治疗已成为研究热点。目前研究报道较多的主要有基于树突状细胞(dendritic cells,DC)及自然杀伤(natural killer,NK)细胞对癌症的主动靶向治疗,或通过在体外激活、扩增具有抗肿瘤活性的自体免疫细胞,将其转输至患者体内,从而发挥抵抗肿瘤的作用。巨噬细胞是固有免疫系统中重要的成分,具有强大的吞噬功能及抗原递呈能力。巨噬细胞能够通过模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)来识别、杀伤病原微生物以及处理、清除损伤和机体衰老的细胞,构成了免疫系统识别"非己"的第一道防线。此外,巨噬细胞还能对外来的抗原进行摄取,在胞内处理后,将其提呈给免疫细胞进行识别,进而介导适应性免疫应答,是机体重要的APC之一。因此,巨噬细胞被称为连接固有免疫应答及适应性免疫应答的纽带。值得注意的是,巨噬细胞具有异质性,可在不同细胞因子的刺激下向M1型及M2型极化,发挥介导炎症反应、抗肿瘤或免疫调节等相应的生物学功能。越来越多的研究显示,巨噬细胞的极化失衡与多种免疫相关疾病如肿瘤的发生发展密切相关。近年来,针对调控巨噬细胞极化的靶分子的研究成为新热点。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)属于PRR家族,能够泛特异性地识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),从而启动固有免疫应答,是机体固有免疫应答的重要防线。TLRs家族广泛表达于多种细胞,在巨噬细胞上表达丰富。其中,表达于细胞表面的TLR4主要识别来自细菌的成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),通过激活下游NF-κB信号通路,释放IL-1β、IL-6等炎症因子,介导炎症反应;而细胞内体的TLR9,可以识别来源于细菌或病毒的CpGDNA,激活下游MAPK通路,促使干扰素刺激因子IRF3、IRF5、IRF7向下游转录生成大量Ⅰ型干扰素,参与抗病毒及抗肿瘤的免疫应答。考虑到肝肠轴的存在,HCC患者往往会伴随肠道功能的紊乱,由肠道来源的大量细菌或病毒会随肝肠轴迁至肝脏,进一步加剧患者肝脏的炎症反应。因此,本研究以TLR4的激动剂LPS、TLR9激动剂CpG-ODN为研究对象,在体外观察它们刺激的巨噬细胞极化的情况,从巨噬细胞分泌的细胞因子和巨噬细胞与肿瘤细胞间的直接作用两方面着手,探讨经TLR4及TLR9刺激的巨噬细胞对肝癌细胞生物学特征的影响。研究方法1.采用普通PCR检测小鼠巨噬细胞系RAW264.7及小鼠原代腹腔巨噬细胞中TLR1-TLR9的基础以及LPS、CpG-ODN诱导巨噬细胞后,TLR1-TLR9的表达情况;2.采用western blot实验检测经LPS或CpG-ODN刺激后的巨噬细胞NF-κB的活化情况;3.Real Time-PCR法检测经LPS或CpG-ODN刺激的小鼠巨噬细胞炎症相关细胞因子的表达;4.采用Real Time-PCR法检测经LPS或CpG-ODN刺激的小鼠巨噬细胞极化相关细胞因子的mRNA水平;用CD206标记M2型巨噬细胞,流式细胞术检测经LPS或CpG-ODN刺激后的巨噬细胞M2型巨噬细胞的比例;流式细胞术检测LPS或CpG-ODN刺激后的巨噬细胞MHC Ⅱ类分子的表达;5.流式细胞术及免疫荧光动态拍摄检测经LPS或CpG-ODN刺激的巨噬细胞对Hepal-6细胞的吞噬作用;6.划痕实验检测经LPS或CpG-ODN刺激的小鼠巨噬细胞自身迁移情况,采用Real Time-PCR法检测经LPS或CpG-ODN刺激的小鼠巨噬细胞趋化因子的表达。7.用TLR4、TLR9激动剂刺激腹腔巨噬细胞24h,去除刺激剂后,使巨噬细胞自分泌48h,收集巨噬细胞条件培养基,放入Transwell下室,检测上室Hepa1-6细胞在条件培养基中的迁移能力;利用Western Blot方法检测经巨噬细胞条件上清孵育12小时的Hepa1-6细胞迁移相关信号通路的活化情况;8.用TLR4、TLR9激动剂刺激腹腔巨噬细胞24h,去除刺激剂后,使巨噬细胞自分泌48h,收集巨噬细胞条件培养基,放入Transwell下室,检测上室Hepa1-6细胞在条件培养基中的侵袭作用;利用Western Blot方法检测经巨噬细胞条件上清孵育12小时的Hepa1-6细胞Stat3信号通路的活化情况;9.采用RTCA、流式细胞术检测肝癌细胞在经LPS或CpG-ODN刺激的巨噬细胞条件上清中增殖、凋亡及周期的变化;10.采用MTT的方法检测脾细胞对经过巨噬细胞条件上清孵育后的肝癌细胞的杀伤作用;11.Transwell迁移模型检测经巨噬细胞条件上清孵育后的Hepa1-6对脾细胞的招募作用;12.流式细胞术检测招募过来的脾细胞中CD8+T、CD4+T、NK1.1+细胞的活化情况;13.流式细胞术检测经巨噬细胞条件上清孵育的Hepa1-6其PD-L1的表达。研究结果1.LPS刺激原代腹腔巨噬细胞后,TLR4表达上调;CpG-ODN刺激原代腹腔巨噬细胞后,TLR9表达升高;2.LPS、CpG-ODN刺激原代腹腔巨噬细胞后,NF-κB信号通路活化;3.LPS 或 CpG-ODN 刺激的小鼠巨噬细胞 IL-1β、IL-18、IL-36α、IL-37mRNA水平表达升高,但是LPS的诱导能力显著强于CpG-ODN;4.LPS刺激的小鼠巨噬细胞中IL-10的mRNA水平下调,而CpG-ODN刺激的小鼠巨噬细胞中IL-10的mRNA水平上升;LPS刺激后的小鼠巨噬细胞CD 206分子荧光强度下调,MHC Ⅱ类分子表达上调,而CpG-ODN刺激后的小鼠巨噬细胞CD 206分子荧光强度增强,MHC Ⅱ类分子表达下降;5.CpG-ODN刺激的巨噬细胞对Hepa1-6细胞的吞噬作用增强;6.LPS或CpG-ODN刺激的小鼠巨噬细胞迁移能力增强,趋化因子CCL3/4/5/12、CXCL1/10 的 mRNA 水平表达上升;7.肝癌细胞在LPS刺激的巨噬细胞条件上清中的迁移能力增强;8.肝癌细胞在LPS、CPG-ODN刺激的巨噬细胞条件上清中的侵袭能力增强;9.LPS、CpG-ODN刺激的巨噬细胞条件上清抑制肝癌细胞的增殖、促进肝癌细胞的凋亡;10.Hepa1-6细胞经LPS或CpG-ODN刺激的巨噬细胞条件上清孵育后,脾脏细胞对Hepa1-6的杀伤无明显影响;11.Hepa1-6细胞经LPS刺激的巨噬细胞条件上清孵育后,其招募脾脏淋巴细胞能力增强;12.肝癌细胞经LPS、CpG-ODN刺激的巨噬细胞条件上清孵育后,肝癌细胞招募的脾脏淋巴细胞中,CD8+T、CD4+T、NK1.1+细胞的活化无明显变化;13.肝癌细胞经LPS、CpG-ODN刺激的巨噬细胞条件上清孵育后,其PD-L1的表达无明显变化。结论及意义1.本文发现LPS刺激巨噬细胞后,巨噬细胞M1/M2的比例上调;而CpG-ODN刺激巨噬细胞后,巨噬细胞M1/M2的比例下降,证明LPS与CpG-ODN刺激的巨噬细胞极化方向不一致。2.LPS诱导巨噬细胞表达炎症因子的能力显著强于CpG-ODN,并且LPS、CpG-ODN可以促进巨噬细胞的迁移。3.本文发现LPS、CpG-ODN可以提高巨噬细胞对HCC细胞的吞噬能力,其条件上清对肝癌细胞的增殖有抑制作用,并可促进肝癌细胞的凋亡;但同时LPS、CpG-ODN刺激的巨噬细胞对HCC的迁移和侵袭具有一定的促进作用。4.本文研究进一步阐述了巨噬细胞对HCC发生发展的影响,并为临床合理应用TLR激动剂治疗HCC进行提供了实验依据。