本研究克隆了马铃薯甲虫类胰岛素信号通路关键组分akt(蛋白激酶B)及tsc1和tsc2基因,进行多重序列比对和系统发育分析,通过qPCR技术,对几个基因的时空表达进行了分析,研究几个关键基因在幼虫生长发育过程中的功能以及对其糖脂代谢的影响,并探究了类胰岛素与保幼激素和蜕皮激素中互作中的紧密联系,通过RNAi技术对几个关键基因的功能与激素互作调节关系进行了阐述。鉴于akt在进化中基因功能稳定的传递及幼虫显著降低的化蛹和羽化率,推荐akt作为害虫防治的新靶标。本文章主要获得了以下的结果:1.马铃薯甲虫类胰岛素途径关键基因的序列比对和系统发育分析通过NCBI在线BLAST将马铃薯甲虫akt基因翻译的氨基酸序列进行相似性搜索比对,将5种昆虫的氨基酸序列比对后发现,LdAKT与其他物种的AKT的序列一致性比较高,这表明Ldakt基因在进化过程中具有较好的保守性。利用NJ系统发育构树方法发现,马铃薯甲虫与鞘翅目的光肩星天牛Anoplophora glabripennis和白蜡窄吉丁Agrilus planipennis亲缘关系较近,且聚为一支。在线BLAST将马铃薯甲虫tsc1/2基因翻译的氨基酸序列进行相似性搜索比对,在与不同目昆虫的直系同源编码的氨基酸序列比对后,可知,tsc1和tsc2基因分别编码了hamartin和tuberin蛋白,且蛋白序列彼此间沒有一致性。LdTSC1与鞘翅目的玉米根萤叶甲DvTSC1且聚为一支,自展一致度为100%;马铃薯甲虫LdTSC2与鞘翅目的玉米根萤叶甲DvTSC2和赤拟谷盗TcTSC2聚为一支,自展一致度为100%;其他各目昆虫的TSC2各自聚成小类群(图2-4),表明LdTSC2在进化过程中较LdTSC1有更好的保守性。2.马铃薯类胰岛素关键基因的时空表达谱:(1)龄期表达通过qPCR分析,在马铃薯甲虫的不同发育龄期的表达差异时发现Ldakt在卵、1龄幼虫表达相对较低,随后在3龄逐渐增高,4龄幼虫表达量最高。Ldtsc1在卵、1龄幼虫表达相对较低,随后在2龄和4龄幼虫期表达量逐渐增高。Ldtsc2在卵、1龄幼虫表达相对较低,随后在1龄末,2龄初以及4龄第三天表达量较高。(2)组织表达对马铃薯甲虫三龄幼虫6个组织测定的组织相对表达量,结果表明这个基因在各个组织中没有表现较为一致的表达方式,每个组织之间的表达均有差异。在Ldakt基因的表达量在脑和血淋巴中相对较高;Ldtsc1基因的表达量在脑和血淋巴中相对较高;Ldtsc2基因的表达量在脑和中肠中相对较高。3.RNAi敲低胰岛素途径关键基因后对马铃薯甲虫生长发育的影响通过喂食二龄初幼虫敲低靶标基因Ldakt和Ldtsc1/2后时,检测到试虫的各组织中表达量下降,出现体重减轻,脂肪体减少以及发育延迟,同时幼虫出现一定程度的死亡率,对化蛹率和羽化率均有显著影响。级联反应导致大部分试虫出现延迟入土且不能正常化蛹,易形成黑化蛹,致使大部分蛹不能正常羽化。4.马铃薯甲虫胰岛素途径关键基因对幼虫糖脂代谢的影响研究显示,沉默Ldakt和Ldtsc1/2后,靶基因表达量均下调,其糖脂代谢也会阻滞。研究发现试虫摄入的葡萄糖进入血淋巴后,葡萄糖的吸收和利用均降低;而海藻糖在检测组织内大量富集,脂肪体内海藻糖分解速率降低,致使糖原合成量减少;组织内脂质甘油三酯及总胆固醇合成量均降低。试虫的糖脂代谢紊乱,类胰岛素关键基因表达量下调后降低幼虫体内的合成代谢,并严重影响了幼虫的发育。5.马铃薯甲虫胰岛素途径关键基因与保幼激素与蜕皮激素的交叉对话本研究进一步通过检测沉默Ldakt体内试虫保幼激素合成基因Ldjhamt,保幼激素静止激素Ldas-c或保幼激素类似物Ldkr-h1,蜕皮激素合成相关基因Ldptth、LdshdD和Ldftz-f1,它们的转录水平均出现不同程度的降低,结果发现类胰岛素可能正向调控蜕皮激素和保幼激素。