禽白血病(Avian Leucosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病毒(Avian Sarcoma Virus,ASV)群中的病毒感染引起的多种肿瘤性疾病的统称。根据病毒与宿主特异性相关的gp85蛋白抗原性的差异以及交叉中和试验等,将禽白血病病毒分为A、B、C、D、E和J等亚群,其中商品鸡群中以J亚型(ALV-J)的致病性和感染性最强。该病主要通过先天感染和水平接触感染传播,在蛋鸡、肉鸡以及我国地方品系鸡群中都有发生,造成鸡群免疫抑制、肿瘤性死亡,继发感染等危害,给养禽业带来巨大经济损失。由于ALV-J基因序列的复杂性及其抗原变异性,到目前为止还缺乏有效的疫苗和药物,只能通过种群净化控制该病。但由于养殖管理不规范,净化不彻底等原因,该病在养禽地区的传播依旧普遍,特别是在发展中国家。因此,亟需探索新的方法控制ALV的感染和散播。泰山松花粉多糖(Taishan pinus pollen polysaccharide,TPPPS)是一种天然植物大分子,本实验室之前的研究表明TPPPS具有很好的免疫增强和抗病毒活性,并可以抑制B亚群禽白血病病毒的体外复制。然而,TPPPS是否可以抑制J亚型禽白血病病毒的感染,目前尚不清楚。本研究的重点是探讨TPPPS对ALV-J感染的抑制作用及其作用机制。首先检测了泰山松花粉多糖体外抑制ALV-J的活性和能力,然后通过透射电镜进一步观察了TPPPS与ALV-J粒子之间的相互作用来揭示TPPPS干扰病毒吸附的可能机制;其次,试验中人工构建了一个先天感染ALV-J雏鸡模型来检测TPPPS的体内抗病毒效果;最后,试验评估了TPPPS对急性致瘤性ALV-J感染的作用效果。本研究分以下三部分内容:1.TPPPS体外抗ALV-J的活性及其机制分析1.1 TPPPS体外抗病毒活性为了验证TPPPS的体外抗ALV-J特性,检测了TPPPS对ALV-J在DF-1细胞上的复制能力的影响,且比较了TPPPS作用在病毒感染不同时期时的作用效果。结果显示,TPPPS可以明显抑制ALV-J的体外增殖,并且在病毒感染吸附期的作用效果最佳。1.2透射电镜(TEM)试验为了探究TPPPS干扰病毒吸附的作用方式,用透射电镜观察了TPPPS对ALV-J吸附DF-1细胞的影响。结果显示TPPPS能明显减少DF-1细胞膜表面处于膜融合状态及进入细胞内部的病毒粒子数量。说明TPPPS减少了病毒对细胞的吸附和感染。随后又通过负染观察来TPPPS与ALV-J粒子的相互作用。发现TPPPS与ALV-J粒子混合后,会明显影响ALV-J粒子的形态和分布,病毒粒子呈现不规则形态,并且发生聚集。这证明TPPPS与ALV-J病毒粒子确实发生了直接作用。2.TPPPS对先天感染ALV-J鸡的免疫调理及抗病毒作用研究2.1 ALV-J先天感染雏鸡模型的建立ALV-J的主要传播方式为通过种鸡经鸡蛋(胚)向下一代垂直传播,引起出壳后的雏鸡免疫抑制,呈现持久的病毒血症,生产性能下降。本研究选用7胚龄鸡胚卵黄囊接种不同浓度(101、102、103、104 TCID50)的ALV-J,比较其孵化率。选取保证所有雏鸡孵化的最高病毒剂量(103 TCID50)作为构建先天感染雏鸡模型的病毒接种剂量。2.2 TPPPS对先天感染ALV-J鸡的体内抗病毒作用研究研究表明TPPPS对ALV-B有很好的抗病毒活性。本研究通过给予先天感染ALV-J雏鸡TPPPS作用,分析多糖对ALV-J的体内抗病毒作用。结果显示,TPPPS作用后的雏鸡泄殖腔排毒量明显下降,且排毒的开始时间延迟了接近一个周。这对减轻ALV-J的水平传播具有重大的意义。同时,TPPPS还降低了免疫器官的带毒量,减轻了病毒对免疫器官的损伤。这表明TPPPS在先天感染ALV-J鸡体内同样具有显著的抗病毒活性。2.3 TPPPS对先天感染ALV-J鸡的免疫调理作用研究试验证明,TPPPS可以增强机体免疫力,对环磷酰胺导致的免疫抑制小鼠有免疫恢复作用。ALV-J的先天感染引起鸡体明显的免疫抑制,而TPPPS调理后鸡体的免疫状况明显改善,具体表现为体重和免疫器官指数,外周血淋巴细胞增殖率,淋巴细胞数量,细胞因子的分泌和ND抗体的水平等各项免疫指标均有明显的提高。说明TPPPS可以作为一种免疫增强剂,以减轻ALV-J先天感染造成的免疫抑制现象。3.TPPPS对感染急性致瘤性ALV-J鸡的抗肿瘤作用研究Fu-J病毒是一种ALV-J相关的急性致瘤性病毒,可以快速引起感染鸡的肿瘤。为了探究TPPPS对ALV-J引起肿瘤的抑制作用,选取7日龄雏鸡颈部皮下接种Fu-J病毒,并于接种前和/或接种后给予连续的TPPPS给药,之后每天观察感染鸡的临床症状,肿瘤的生长状况及死亡率情况等。结果显示,多糖在病毒接种前的预处理可以在一定程度上延迟肿瘤的发生,抑制肿瘤的生长。